[發明專利]一種高純度提取土壤微生物總DNA的方法

無效

• 申請號: 201210096840.3
• 申請日: 2012-04-05
• 公開（公告）號: CN102643797A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 于翠;胡興明;鄧文;葉楚華;熊超;彭波;李勇
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院經濟作物研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種高純度提取土壤微生物總DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟：

采用CTAB、CaCl₂、BSA-溶菌酶、蛋白酶-SDS、PVP-反復凍融法；取5g桑樹根圍土樣，加入13.5mL?DNA提取液II和少許石英砂，漩渦振蕩器振蕩3min；加入100mg/mL溶菌酶150μL、20mg/mL蛋白酶K15μL，混勻，37℃、230r/min搖床中溫育1h；加入1.5mL?10％SDS和0.3g?PVP，混勻，65℃水浴1h；反復凍融3次；8500r/min離心10min；取上清液，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇抽提，酚/氯仿/異戊醇體積比25∶24∶1，8500r/min離心10min；取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇再次抽提，氯仿/異戊醇體積比24∶1，8500r/min離心10min，取上清液；在上清液中加入0.7倍體積異丙醇和0.1倍體積NaAc，-20℃放置過夜，8500r/min，4℃離心20min，沉淀用70％乙醇洗滌，12500r/min離心10min，沉淀室溫晾干，加入200μL?TE溶解沉淀，-20℃保存，即獲得桑樹根圍土壤微生物總DNA；

所述DNA提取液II成分為Tris-HCl?100mmol/L，EDTA?100mmol/L，Na₃PO4?100mmol/L，NaCl?1.5mol/L，1％CTAB，2％CaCl₂，1μg/mL?BSA；pH8.0；所述的土樣，采自桑樹根圍土壤，深度為5～10cm表土層，按5點法取樣，混勻后放入無菌袋中，4℃保存。

2.如權利要求1所述的提取DNA的方法的用途，其特征在于：該方法在進行16SrDNA的擴增及DGGE圖譜分析，與RDP數據庫中已有的序列進行比對，或通過建立新的序列探針識別未知菌，從而確定微生物群落結構組成、結構多樣性及其生態功能。