[發明專利]檢測硝基咪唑類藥物的酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201210096409.9
• 申請日: 2012-04-01
• 公開（公告）號: CN103364553A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 萬宇平;吳鵬;羅曉琴;孫震;馮靜;余厚美;趙正苗;段盈盈;何麗霞;李曉芳
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531;C07D233/94
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技術領域

本發明涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測硝基咪唑類藥物的酶聯免疫試劑盒，其適用于蜂蜜中硝基咪唑類藥物測定。

技術背景

硝基咪唑類藥物是畜禽飼料中常用的抗原蟲感染及抗菌藥，主要用于防治家禽組織滴蟲和寄生蟲、牛的滴蟲，豬的出血性腸炎、魚的寄生蟲感染、蜂的微孢子蟲病等，并具有促生長作用，但是該類藥物及其某些代謝物對哺乳動物具有致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性，因此硝基咪唑類藥物的不合理使用造成可食性動物組織中藥物殘留問題危害到人類的食品安全，我國已經禁止甲硝唑、地美硝唑、洛硝唑在肉食食品中使用，替硝唑禁止在獸藥中使用，因此，需要一種既靈敏又精確的方法同時測定蜂蜜中的硝基咪唑類藥物。

目前檢測硝基咪唑類藥物的方法主要有：高效液相色譜-紫外色譜、高效液相色譜二極管陳列檢測器法，氣相色譜氮磷檢測器法、高效液相色譜-電噴霧質譜法，氣相色譜法等，儀器檢測方法操作繁瑣且費用較高，推廣應用受到限制。

發明內容

本發明的目的在于針對上述不足提供一種用于硝基咪唑類藥物含量測定的酶聯免疫試劑盒，其操作簡單適合現場大批量樣品的篩選。

本發明試劑盒，它包括：

(1)包被有甲硝唑偶聯抗原的酶標板；

(2)酶標記抗抗體；

(3)硝基咪唑類藥物特異性抗體；

(4)甲硝唑標準品溶液；

(5)底物顯色液；

(6)終止液；

(7)濃縮洗滌液；

(8)復溶液。

所述甲硝唑偶聯抗原為甲硝唑半抗原與載體蛋白的偶聯物，所述載體蛋白可為卵清蛋白、牛血清白蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。

所述甲硝唑半抗原的結構如下：

所述甲硝唑半抗原制備過程：0.85g甲硝唑和1.0g琥珀酸酐，加入10ml吡啶，室溫下攪拌12-20小時，蒸干溶劑，乙酸乙酯溶解，飽和氯化銨溶液洗滌，水洗，干燥，除去溶劑后在環己烷-乙酸乙酯中重結晶得到白色固體，為甲硝唑半抗原。

所述酶標記抗抗體的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優選辣根過氧化物酶；酶標記抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與羊抗鼠抗抗體進行偶聯得到的，優選過碘酸鈉法。所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。

所述硝基咪唑類藥物特異性抗體可為硝基咪唑類藥物單克隆抗體或硝基咪唑類藥物多克隆抗體；它們均是用甲硝唑偶聯抗原為免疫原得到的；所述硝基咪唑類藥物特異性抗體可為鼠源、馬源、羊源或兔源抗體，所述硝基咪唑類藥物單克隆抗體優選為硝基咪唑類藥物鼠單克隆抗體，所述硝基咪唑類藥物多克隆抗體優選為硝基咪唑類藥物兔多克隆抗體。

為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括甲硝唑標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、復溶液。

所述濃縮洗滌液為pH7.2-7.6，含有0.5-1.0％吐溫20，0.01-0.04‰疊氮化鈉的0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量百分比。

所述復溶液為pH6.5-6.8含有5-10％酪蛋白的0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量百分比。

當標記酶為辣根過氧化物酶時，顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為堿性磷酸酯酶時，顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為1～2mol/L氫氧化鈉溶液。

其中酶標板在制備過程中所用的包被緩沖液為pH9.0-9.6，0.1-0.2mol/L碳酸鹽緩沖液，所用封閉液為pH7.2-7.6，含有0.5-0.8％脫脂奶粉，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量百分比。

本發明中酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將包被抗原稀釋成0.1～0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封閉液，37℃溫育1～2h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。

本發明的檢測原理為：