[發明專利]豬細小病毒IgM抗體ELISA檢測試劑盒及其制備方法和其應用

無效

• 申請號: 201210095915.6
• 申請日: 2012-04-01
• 公開（公告）號: CN103364552A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 廖園園;漆世華;李建;秦偉;張萍;謝紅玲;溫文生
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 北京智匯東方知識產權代理事務所(普通合伙) 11391
• 代理人: 康正德;范曉斌

技術領域

本發明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種豬細小病毒(PPV)IgM抗體ELISA檢測試劑盒及其制備方法和其應用。

背景技術

豬細小病毒病(porcine?parvovirus?infection，PPI)又稱豬繁殖障礙病，是由豬細小病毒(porcine?parvovirus，PPV)引起的一種豬的繁殖障礙病，也是引起母豬繁殖障礙的主要疾病之一。懷孕母豬主要表現為流產、死胎、木乃伊胎、弱仔等，以頭胎母豬最為嚴重，給全球的養豬業造成巨大的經濟損失。

目前，PPV感染尚無有效的藥物治療方法。近年來，已公認使用疫苗是預防PPV感染，提高母豬繁殖率的唯一方法。雖然滅活苗安全性最好，但實驗表明，PPV可被充分致弱，即使在懷孕期間不慎接種，也不可能引起繁殖障礙。建議對血清學陰性的母豬和公豬進行免疫接種。因此，研制PPV血清抗體檢測試劑盒的臨床需求日益迫切，而檢測豬PPV特異性IgM抗體為早期診斷該疾病提供了新的方法。

目前，已經建立了許多先進實用的診斷和檢測PPV抗體和PPV抗原的方法，如間接免疫熒光試驗(IFA)、血凝試驗和血凝抑制試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)以及RT-PCR方法等。盡管這些方法可以檢測PPV或抗體水平，但極少檢測PPV?IgM抗體。國外已有的檢測豬IgM抗體的試劑盒主要用于檢測豬IgM抗體，而不能檢測特異性抗原的抗體，即檢測抗何種病原的抗體，如PPV?IgM抗體。

發明內容

本發明的目的在于提供一種豬細小病毒IgM抗體ELISA檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有：包被豬IgM單克隆抗體的酶標板、封閉液、樣品稀釋液、檢測用抗原、酶結合物、濃縮洗滌液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和終止液，其中，所述檢測用抗原為純化的豬細小病毒，所述的酶結合物為辣根過氧化物酶-抗PPV抗體酶結合物。

本發明的優選技術方案中，所述的包被豬IgM單克隆抗體的酶標板孔包被豬IgM單克隆抗體的包被量為0.1μg-1μg/孔，包被稀釋液為0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，其中，所述碳酸鹽緩沖液的pH9.6。

本發明的優選技術方案中，所述碳酸鹽緩沖液的組成為，每升碳酸鹽緩沖溶液中含有1.59g?Na₂CO₃和2.93g?NaHCO₃。

本發明的優選技術方案中，所述封閉液選自質量濃度為1-10％的BSA、質量濃度為1-10％的脫脂牛奶的任一種或其組合。

本發明的優選技術方案中，所述樣品稀釋液由質量濃度為0.1-10％牛血清白蛋白(BSA)和含有0.01-0.05％NaN₃的磷酸鹽緩沖液(PBS)組成，其中，所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0.01mol/L，pH7.2-7.4。

本發明的優選技術方案中，所述濃縮洗滌液為含有0.5v/v％吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，其中，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.1mol/L，pH7.2-7.4。

本發明的優選技術方案中，所述的酶底物A溶液為1％的3，3’-5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)溶液；所述的酶底物B溶液為含有0.012％雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為1％，pH5.0。

本發明的優選技術方案中，所述終止液為1mol/L?H₂SO₄溶液。

本發明的優選技術方案中，所述樣品稀釋液的配制為：配制pH7.2-7.4、濃度為0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液，再加入BSA和NaN₃，使其濃度分別為0.1-10％BSA和0.01-0.05％NaN₃，即得。

本發明的優選技術方案中，所述濃縮洗滌液的配制為：在0.1mol/L?PBS溶液中加入吐溫-20(Tween-20)，使得吐溫-20的濃度為0.5v/v％。

本發明的優選技術方案中，所述的酶底物A溶液為1％的3，3’-5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)溶液，其配制為：稱取100mg?TMB，將其加入到10ml二甲基亞砜(DMSO)中，完全溶解后，即得。

本發明的優選技術方案中，所述的酶底物B溶液為0.012％雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為1％，pH5.0，其配制為：稱取10g乙酸鈉，溶于1L純化水，用乙酸調pH5.0，再加入400μl濃度為30％H₂O₂，即得。

本發明的優選技術方案中，用酶底物B溶液100倍稀釋酶底物A溶液制得顯色液。