[發(fā)明專利]豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體ELISA檢測試劑盒及其制備方法和其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210095894.8
• 申請日: 2012-04-01
• 公開（公告）號: CN103364551A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 廖園園;漆世華;李建;劉潔;秦偉;謝紅玲;溫文生
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;C12N7/02
• 代理公司: 北京智匯東方知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11391
• 代理人: 康正德;范曉斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)IgM抗體ELISA檢測試劑盒及其制備方法和其應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine?Reproduct?ive?and?Respiratory?Syndrome，PRRS)又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine?reproduct?ive?and?respiratory?syndrome?virus，PRRSV)引起的一種以感染豬發(fā)熱、厭食，妊娠母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎和木乃伊胎，各種年齡豬(特別是仔豬)呼吸障礙為特征的高度傳染性疾病。自1987年發(fā)現(xiàn)至今，已波及世界各地，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的損失。據(jù)報道，PRRS在國內(nèi)大部分養(yǎng)豬地區(qū)都有流行，感染率達到58％以上。血清學(xué)檢測是制定和實施PRRS防制措施的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，研制PRRSV血清抗體檢測試劑盒的臨床需求日益迫切，而檢測豬PRRSV特異性IgM抗體為早期診斷該疾病提供了新的方法。

根椐病毒基因組的差異，可將PRRSV分為以Lelystade株為代表的歐洲型毒株和以ATTC-VR-2332為代表的美洲型毒株。我國分離到的毒株經(jīng)核苷酸序列分析表明為美洲型。

目前，已經(jīng)建立了許多先進實用的診斷和檢測PRRS抗體和PRRSV抗原的方法，如間接免疫熒光試驗(IFA)、免疫過氧化物酶單層試驗(IPAM)、血清中和試驗(SN)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、RT-PCR方法等。盡管這些方法可以檢測PRRSV或抗體水平，但極少檢測PRRSV?IgM抗體。國外已有的檢測豬IgM抗體的試劑盒主要用于檢測豬IgM抗體，而不能檢測特異性抗原的抗體，即檢測抗何種病原的抗體，如PRRSV?IgM抗體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體ELISA檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有：包被豬IgM單克隆抗體的酶標(biāo)板、封閉液、樣品稀釋液、檢測用抗原、酶結(jié)合物、濃縮洗滌液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和終止液，其中，所述檢測用抗原為純化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，所述的酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶-抗PRRSV抗體酶結(jié)合物。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的包被豬IgM單克隆抗體的酶標(biāo)板孔包被豬IgM單克隆抗體的包被量為0.1μg-1μg/孔，包被稀釋液為0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，其中，所述碳酸鹽緩沖液的pH9.6。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述碳酸鹽緩沖液的組成為，每升碳酸鹽緩沖溶液中含有1.59g?Na₂CO₃和2.93g?NaHCO₃。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述封閉液選自質(zhì)量濃度為1-10％的BSA、質(zhì)量濃度為1-10％的脫脂牛奶的任一種或其組合。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述樣品稀釋液由質(zhì)量濃度為0.1-10％牛血清白蛋白(BSA)和含有0.01-0.05％NaN₃的磷酸鹽緩沖液(PBS)組成，其中，所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0.01mol/L，pH7.2-7.4。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述濃縮洗滌液為含有0.5v/v％吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，其中，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.1mol/L，pH7.2-7.4。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的酶底物A溶液為1％的3，3’-5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液；所述的酶底物B溶液為含有0.012％雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為1％，pH5.0。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述終止液為1mo?l/L?H₂SO₄溶液。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述樣品稀釋液的配制為：配制pH7.2-7.4、濃度為0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液，再加入BSA和NaN₃，使其濃度分別為0.1-10％BSA和0.01-0.05％NaN₃，即得。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述濃縮洗滌液的配制為：在0.1mol/L?PBS溶液中加入吐溫-20(Tween-20)，使得吐溫-20的濃度為0.5v/v％。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的酶底物A溶液為1％的3，3’-5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，其配制為：稱取100mg?TMB，將其加入到10mi二甲基亞砜(DMSO)中，完全溶解后，即得。