[發(fā)明專利]蘋果種質(zhì)資源改良TP-M13-SSR分子標(biāo)記方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210095250.9
• 申請(qǐng)日: 2012-03-31
• 公開（公告）號(hào): CN102653790A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王昆;高源;龔欣;劉立軍;王大江;劉鳳之
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 葫蘆島天開專利商標(biāo)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 21230
• 代理人: 魏勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及果樹分子生物學(xué)技術(shù)，具體地說(shuō)是蘋果種質(zhì)資源改良TP-M13-SSR分子標(biāo)記方法。

背景技術(shù)

蘋果屬(Malus?Mill.)種質(zhì)資源豐富，品種類型多樣，包括大量的野生種、半野生種及栽培品種。蘋果種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒定是種質(zhì)資源保存和利用的前提，以往主要利用形態(tài)學(xué)觀察、同工酶等方法進(jìn)行鑒定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其在蘋果種質(zhì)資源的研究中也得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

自Litt和Luty首次將SSR技術(shù)(simple?sequence?repeat，即簡(jiǎn)單序列重復(fù)又稱微衛(wèi)星)用于進(jìn)行人類遺傳學(xué)研究以來(lái)，SSR技術(shù)因多態(tài)性高、分布廣、重復(fù)性好、共顯性以及成本較低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，也因此而被應(yīng)用到蘋果種質(zhì)資源的鑒定中。傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記PCR產(chǎn)物檢測(cè)采用的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，分析通量較低、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)流程繁瑣、數(shù)據(jù)記錄的工作量過(guò)大。而熒光測(cè)序技術(shù)即毛細(xì)管電泳技術(shù)在SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)上的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)收集和處理的自動(dòng)化，克服了銀染法的不足。但其一個(gè)重要限制因素即是其成本過(guò)高，一旦實(shí)驗(yàn)需要增加另外的SSR位點(diǎn)時(shí)，又必須得重新合成新增位點(diǎn)的熒光引物，該技術(shù)也僅僅在少量材料和較少位點(diǎn)的研究中應(yīng)用較多。

TP-M13-SSR分子標(biāo)記技術(shù)是將SSR分子標(biāo)記技術(shù)、熒光測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的高通量、低成本的高效、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，如何能將兩次PCR程序合并為一次，不同SSR分子標(biāo)記引物合并到同一體系中，則可減少操作步驟，最大限度的減少人為實(shí)驗(yàn)誤差，并且可以進(jìn)一步的提高實(shí)驗(yàn)效率。

發(fā)明內(nèi)容

為了能夠?qū)P-M13-SSR分子標(biāo)記技術(shù)中不同SSR分子標(biāo)記引物合并到同一體系中，并能將兩次PCR程序合并為一次，盡可能地減少操作步驟，最大限度的減少人為實(shí)驗(yàn)誤差，進(jìn)一步的提高實(shí)驗(yàn)效率。本發(fā)明提出了蘋果種質(zhì)資源改良的TP-M13-SSR分子標(biāo)記技術(shù)。

本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的方案是：

1、提取蘋果基因組DNA，并稀釋到20?ng/μL。

2、SSR熒光標(biāo)記反應(yīng)：

（1）TP-M13-SSR反應(yīng)體系：?

模板DNA：2.0ul；

Mg²⁺（25mM）：1.62ul；

TP-M13-SSR引物1：P-Primer（2uM）：1.2?ul；F-Primer（2uM）：0.12?ul；?

TP-M13-SSR引物2：P-Primer（2uM）：1.2?ul；F-Primer（2uM）：0.12?ul；

TP-M13-SSR引物3：P-Primer（2uM）：1.2?ul；F-Primer（2uM）：0.12?ul；?

同一熒光標(biāo)記的M13接頭：1.8?ul；

Buffer(10×)：2.25ul；

dNTP(25?mM)：0.18?ul；

Taq(5u/ul)：0.24?ul；

ddH₂O：2.95?ul；

Total：15?ul。

（2）PCR程序：

94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，An.T退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，16個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min；4℃保存。不同引物擴(kuò)增所需要的An.T即退火溫度不同，因此需要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確定在同一體系中的三對(duì)引物具有相同的退火溫度。

三對(duì)具有相同退火溫度的TP-M13-SSR引物與同一熒光顏色的M13接頭在15?ul的反應(yīng)體系中，采用兩套循環(huán)的一次PCR反應(yīng)，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)一次PCR反應(yīng)三對(duì)TP-M13-SSR引物的PCR擴(kuò)增及同一顏色的熒光標(biāo)記。

3、TP-M13-SSR標(biāo)記的熒光檢測(cè)

TP-M13-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化，不同熒光顏色標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（最多四色）在毛細(xì)管電泳儀（如ABI3730）上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

4、數(shù)據(jù)分析：

電泳結(jié)束后，得到數(shù)據(jù)利用Genescan和Genotyper兩套軟件進(jìn)行分析，自動(dòng)獲取所有數(shù)據(jù)，最后得到所有樣品的毛細(xì)管電泳圖譜，即SSR指紋圖譜，從而完成TP-M13-SSR熒光標(biāo)記。