[發(fā)明專利]蘋果種質(zhì)資源改良TP-M13-SSR分子標(biāo)記方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210095250.9
• 申請(qǐng)日: 2012-03-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102653790A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王昆;高源;龔欣;劉立軍;王大江;劉鳳之
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 葫蘆島天開(kāi)專利商標(biāo)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 21230
• 代理人: 魏勇

1.?蘋果種質(zhì)資源改良TP-M13-SSR分子標(biāo)記方法，利用毛細(xì)管電泳儀，將毛細(xì)管電泳技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，不同SSR分子標(biāo)記引物合并到同一體系，并將兩次PCR程序合并為一次，建立改良TP-M13-SSR分子標(biāo)記方法，其特征是：

實(shí)驗(yàn)步驟：

1）、提取蘋果基因組DNA，并稀釋到20?ng/μL；

2）、SSR熒光標(biāo)記反應(yīng)：

（1）TP-M13-SSR反應(yīng)體系：?

模板DNA：2.0ul；

Mg²⁺（25mM）：1.62ul；

TP-M13-SSR引物1：P-Primer（2uM）：1.2?ul；F-Primer（2uM）：0.12?ul；?

TP-M13-SSR引物2：P-Primer（2uM）：1.2?ul；F-Primer（2uM）：0.12?ul；

TP-M13-SSR引物3：P-Primer（2uM）：1.2?ul；F-Primer（2uM）：0.12?ul；?

同一熒光標(biāo)記的M13接頭：1.8?ul；

Buffer(10×)：2.25ul；

dNTP(25?mM)：0.18?ul；

Taq(5u/ul)：0.24?ul；

ddH₂O：2.95?ul；

Total：15?ul；

（2）PCR程序：

94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，An.T退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，16個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min；4℃保存；不同引物擴(kuò)增所需要的An.T即退火溫度不同，因此需要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確定在同一體系中的三對(duì)引物具有相同的退火溫度；

三對(duì)具有相同退火溫度的TP-M13-SSR引物與同一熒光顏色的M13接頭在15?ul的反應(yīng)體系中，采用兩套循環(huán)的一次PCR反應(yīng)，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)一次PCR反應(yīng)三對(duì)TP-M13-SSR引物的PCR擴(kuò)增及同一顏色的熒光標(biāo)記；

3）、TP-M13-SSR標(biāo)記的熒光檢測(cè)：

TP-M13-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化，不同熒光顏色標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管電泳儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

4）、數(shù)據(jù)分析：

電泳結(jié)束后，得到數(shù)據(jù)利用Genescan和Genotyper兩套軟件進(jìn)行分析，自動(dòng)獲取所有數(shù)據(jù)，最后得到所有樣品的毛細(xì)管電泳圖譜，即SSR指紋圖譜，從而完成TP-M13-SSR熒光標(biāo)記。