[發(fā)明專利]快速純化及制備細菌PCR反應(yīng)模板的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210095106.5
• 申請日: 2012-03-31
• 公開（公告）號: CN102533739A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 解宇
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12R1/19
• 代理公司: 杭州裕陽專利事務(wù)所(普通合伙) 33221
• 代理人: 應(yīng)圣義

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，尤其涉及了一種快速純化及制備細菌PCR反應(yīng)模板的方法。

背景技術(shù)

PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病原菌的診斷，具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。自然標本中因含有大量的雜菌及異物（包括PCR反應(yīng)抑制物），對自然標本中特定病原菌的檢測，一般先使用針對該病原菌的特定培養(yǎng)液進行增菌培養(yǎng)，或使用平板（鑒別）培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后取增菌液或挑取平板培養(yǎng)基中疑似的病原菌菌落，制備PCR反應(yīng)模板，進行PCR檢測。由于自然標本中存在PCR反應(yīng)抑制物，因此不宜省略增菌培養(yǎng)或鑒別培養(yǎng)的步驟。在整個檢測過程中，增菌培養(yǎng)及平板（鑒別）培養(yǎng)耗時費力。

本研究以磁性細菌由來的磁珠（bacterial?magnetic?particles，?BMPs）為載體^[1、2]，合成免疫BMPs^[2、3]，使用免疫BMPs，直接對糞便標本中的大腸桿菌O157進行捕獲、分離和洗凈，不進行增菌培養(yǎng)及平板（鑒別）培養(yǎng)，探討快速純化及制備細菌PCR反應(yīng)模板的方法。使用免疫BMPs快速純化細菌PCR反應(yīng)模板，旨在縮短檢測時間，去除自然標本中存在的PCR反應(yīng)抑制物等影響檢測的成分。同時，也可以考慮應(yīng)用于某些在人工培養(yǎng)基中培養(yǎng)困難的病原菌的PCR反應(yīng)模板的制備。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，縮短了檢測時間，利用免疫BMPs捕獲自然標本（糞便）中的目標病原菌，通過分離和洗凈，去除標本中存在的PCR反應(yīng)抑制物等影響因素，可省略增菌培養(yǎng)及鑒別培養(yǎng)，快速純化目標病原菌的PCR反應(yīng)模板的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決：

快速純化及制備細菌PCR反應(yīng)模板的方法，包括以下步驟：

步驟a：牛糞便標本中添加PBS溶液5?mL，混勻，1000?r/min離心30?s，去除大顆粒的雜質(zhì)；

步驟b：向含菌的牛糞稀釋液中添加免疫BMPs?0.3?mg，混合均勻，反應(yīng)30?min后進行磁性誘導，從牛糞中分離出磁性凝集物；

步驟c：分離出來的磁性凝集物使用PBS溶液分散清洗3次，清洗后，添加滅菌雙蒸水100?μL，分散，重新振蕩懸浮后至95℃加熱5?min；再經(jīng)12000?r/min離心5?min；

步驟d：回收上清液，制得PCR反應(yīng)模板。

作為優(yōu)選，所述的PBS溶液的ph值為6.8。

作為優(yōu)選，所述的磁性誘導采用普通磁石進行誘導。

作為優(yōu)選，所述的牛糞便標本中的大腸桿菌O157濃度為1～10^4?cfu/g。

BMPs系穩(wěn)定的單磁疇晶體，不同于一般合成磁珠的多磁區(qū)構(gòu)造，在溶液中分散性能明顯優(yōu)于普通鐵氧體磁珠，反應(yīng)表面積相對穩(wěn)定，檢測的敏感性及穩(wěn)定性較好^[1、2]。另外，通常在人工合成的無機磁珠表面進行生物包被或修飾后穩(wěn)定性欠佳，而BMPs能改善這一現(xiàn)象，大量實驗結(jié)果均表明修飾后免疫BMPs的穩(wěn)定性及可操作性良好^[2、4、5]。

本研究的結(jié)果表明，對于大腸桿菌O157濃度為1～10^4?cfu/g的牛糞便標本，使用免疫BMPs處理后制備PCR反應(yīng)模板，PCR檢測結(jié)果，與通過增菌及平板培養(yǎng)后制備PCR反應(yīng)模板，檢測結(jié)果一致。表明使用免疫BMPs，可以直接對糞便標本中的大腸桿菌O157進行有效捕獲、分離和洗凈，可省略常規(guī)的增菌培養(yǎng)及平板（鑒別）培養(yǎng)，快速純化細菌的PCR反應(yīng)模板。在大腸桿菌O157濃度低于10^3?cfu/g時，經(jīng)免疫BMPs處理后制備PCR反應(yīng)模板、及通過增菌和平板培養(yǎng)后制備PCR反應(yīng)模板，比糞便標本直接制備PCR反應(yīng)模板，PCR檢測的敏感性明顯增高。

美國農(nóng)業(yè)部動物排泄物病源菌研究實驗室的Shelton等^[6]報告了一種快速定量及確定自然水體和人工水體中存在的大腸桿菌O157的方法，?Shelton等的方法是將大腸桿菌O157的單克隆抗體吸附到人工合成的磁顆粒上，使其與病菌結(jié)合，磁性分離后進行培養(yǎng)檢測。這種方法可以檢出100?mL水中含有的數(shù)個大腸桿菌O157，這一方法有助于衛(wèi)生機構(gòu)對公共水上場所進行檢查。