[發(fā)明專利]一種重組黑麥草花粉過敏原與突變體的制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210095034.4
• 申請日: 2012-03-31
• 公開（公告）號: CN102675439A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陶愛林;董慧峰;鄒澤紅;何穎;陳惠芳;劉雪婷
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/63;A61K39/35;A61P37/08;G01N33/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組黑麥草花粉過敏原與突變體的制備方法和應(yīng)用。?

背景技術(shù)

近幾十年來，隨著工業(yè)化，城市化進(jìn)程的推進(jìn)，變態(tài)反應(yīng)疾病的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。在發(fā)達(dá)國家，近15%?-?30%的人對花粉過敏，在我國，對花粉過敏的病人至少有500-1000萬，且近年來花粉過敏患者的發(fā)病率有持續(xù)上升的趨勢。所以植物花粉過敏原的分子生物學(xué)研究是世界變態(tài)反應(yīng)學(xué)界研究的熱點之一?；ǚ圻^敏癥既與人自身的體質(zhì)有關(guān)也與空氣中花粉的種類和濃度有關(guān)?？諝庵谢ǚ鄣臄?shù)量主要受地域環(huán)境，季節(jié)，氣候和植物自身的生活影響。我國地域遼闊，植物種類繁多，致敏花粉也呈現(xiàn)出多樣性。加之城市綠化的普及，人們接觸花粉的機會增加，使得花粉過敏癥的發(fā)病率有增長的趨勢。花粉變應(yīng)原可導(dǎo)致人體產(chǎn)生變應(yīng)性鼻炎、皮炎、支氣管哮喘等過敏性疾病。因此，對花粉變應(yīng)原的深入研究有利于了解疾病發(fā)生的原因，為開展特異性免疫診療奠定基礎(chǔ)。?

植物花粉是主要的吸入性變應(yīng)原，能誘導(dǎo)人體產(chǎn)生I型超敏反應(yīng)。目前國內(nèi)外對花粉過敏治療所采用的策略多種多樣，其中較為有效的是采取變應(yīng)原特異性免疫治療，簡稱免疫治療(special?immune?treatment，SIT)。這種方法被認(rèn)為是目前唯一的過敏疾病醫(yī)學(xué)治療方法，它可縮短病程、阻滯癥狀的惡化和防治對新的過敏原產(chǎn)生過敏。但也暴露出一些新問題：由于臨床上所采用的變應(yīng)原來源于花粉的粗提液，成分非常復(fù)雜，既包含主要、次要變應(yīng)原以及其它一些非變應(yīng)原蛋白。這就勢必增加引起新的過敏反應(yīng)的可能性。近年來，基因工程的發(fā)展為生產(chǎn)高純度的變應(yīng)原提供了值得考慮的思路和方法，基重組變應(yīng)原替代天然變應(yīng)原提取液在臨床上取得良好的效果。相比較而言，利用基因工程技術(shù)，通過定點突變的方法獲得低過敏原性或無過敏原性的重組黑麥草花粉過敏原的突變體，在一定程度上可從源頭上降低治療過程中的風(fēng)險，同時能夠保留黑麥草花粉過敏原的生物學(xué)活性。另外，重組過敏原的生產(chǎn)條件穩(wěn)定，且標(biāo)準(zhǔn)化程序簡單，有利于廣泛應(yīng)用于臨床的診斷和治療。因此，重組弱化過敏原將是一種很好的替代方法，有廣闊的發(fā)展前景。?

全世界大約有4億人對草花粉過敏，草過敏原分為Group?Ⅰ、Group?Ⅱ、?Group?Ⅲ、Group?Ⅳ及Group?Ⅴ。其中GroupⅤ是最重要的草花粉過敏原，在對草過敏的病人中，有80%的人對GroupⅤ過敏。黑麥草是禾本科黑麥草屬的植物之一，花果期5-7月。Lol?p?5是黑麥草5種花粉過敏原之一，同時也是GroupⅤ草過敏原的代表蛋白。黑麥草的種植不僅能夠提供大量優(yōu)質(zhì)牧草，同時在改善稻田土壤生態(tài)環(huán)境、減少水土流失、減輕農(nóng)業(yè)環(huán)境污染方面具有重要作用。但是黑麥草的廣泛種植，使得黑麥草花粉在空氣中所占比例不斷上升，受到了廣大研究者的重視。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對上述存在的問題及天然黑麥草花粉過敏原純度的不足，在克隆表達(dá)重組黑麥草花粉過敏原的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)軟件分析黑麥草花粉過敏原的抗原表位，突變一個或多個抗原性高的位點，從而獲得低過敏原性的黑麥草花粉過敏原突變體，期望能夠安全高效地應(yīng)用于過敏性疾病的治療。?

本發(fā)明的另一個目的是提供一種編碼上述黑麥草過敏原及其突變體的基因。?

本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述基因的重組質(zhì)粒載體。?

本發(fā)明的另一個目的是提供上述基因轉(zhuǎn)化的重組表達(dá)宿主。?

本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述重組黑麥草花粉過敏原及其突變體的制備方法。?

本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組黑麥草花粉過敏原用作藥物或者診斷試劑的制備方法。?

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：?

本發(fā)明的重組黑麥草花粉過敏原，是天然存在的黑麥草花粉過敏原衍生的非天然存在的變異體，其核酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后，人工合成全長的重組黑麥草花粉過敏原基因。采用生物信息學(xué)軟件分析其抗原表位，針對一個或多個抗原性指數(shù)高的位點進(jìn)行有目的的置換，獲得重組黑麥草花粉過敏原突變體的基因，使其在保持原有生物學(xué)活性和空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，能夠有效地降低重組黑麥草花粉過敏原的過敏原性。然后利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，在人工控制的條件下，獲得高純度的重組黑麥草花粉過敏原及其突變體蛋白。與天然黑麥草花粉過敏原相比，該重組蛋白突變體與特異性IgE的結(jié)合性能明顯減少，可安全地應(yīng)用于過敏性基本的預(yù)防和治療。

一種重組黑麥草花粉過敏原，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。?