[發明專利]一種重組黑麥草花粉過敏原與突變體的制備方法和應用

無效

• 申請號: 201210095034.4
• 申請日: 2012-03-31
• 公開（公告）號: CN102675439A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 陶愛林;董慧峰;鄒澤紅;何穎;陳惠芳;劉雪婷
• 申請（專利權）人: 廣州醫學院第二附屬醫院
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/63;A61K39/35;A61P37/08;G01N33/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

1.一種重組黑麥草花粉過敏原，其特征在于在重組黑麥草過敏原的基礎上衍生的非天然存在的突變體，其中B細胞或/和T細胞表位的至少一個表面暴露的保守氨基酸殘基被在天然存在的過敏原來源的分類學目內任何已知的同源蛋白質氨基酸序列中的相同位置不出現的另一殘基取代，該突變體具有與天然出現的過敏原基本相同的α-碳骨架三級結構。

2.權利要求1所述的一種黑麥草花粉過敏原的突變體，其特征在于其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

3.權利要求1所述一種重組黑麥草花粉過敏原的制備方法，其特征在于包括如下步驟：編碼權利要求1所述重組黑麥草花粉過敏原的基因依據相應的表達宿主的情況通過密碼子優化得到，并以之獲得重組載體后，轉化大腸桿菌、酵母或植物，得到重組宿主，蛋白表達后得到權利要求1所述的重組黑麥草花粉過敏原。

4.根據權利要求3中所述的一種重組黑麥草花粉過敏原的制備方法，其特征在于所述表達宿主是大腸桿菌表達系統，名稱為Escherichia?coli?JM109-Q4DF，并已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC?NO:?M?2011177，保藏日期為2011年5月19日，保藏地點為中國.武漢.武漢大學；該宿主表達與純化后可以獲得權利要求1所述的重組黑麥草花粉過敏原。

5.根據權利要求3所述的一種重組黑麥草花粉過敏原的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)?從數據庫中獲取此蛋白的核酸序列，根據表達宿主的密碼子偏好性對其進行密碼子優化，優化后序列中GC含量為35~65%，原氨基酸序列不變；

(2)?人工合成優化后的核酸序列；

(3)?經雙酶切后，與表達載體連接，構建成重組載體；

(4)?將重組載體轉化表達宿主中，選擇陽性轉化物；

(5)?在20-38℃下，培養陽性轉化物，用濃度為0.01~2.0?mmol/L的誘導劑來誘導重組蛋白表達，誘導溫度為4-38℃；

(6)?所得培養物通過超聲波破碎或其它裂解方法裂解宿主細胞后，通過超濾法、層析法、離心法、等電點沉淀法等純化方法獲得高純度的重組蛋白。

6.權利要求2所述的一種重組黑麥草花粉過敏原的突變體的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（a）采用生物信息學軟件預測權利要求1所述重組黑麥草花粉過敏原的氨基酸序列的優勢抗原表位；

（b）采用定點法改變抗原性高的位點，用天然存在的過敏原來源的分類學目內任何已知的同源蛋白質氨基酸序列中的相同位置不出現的氨基酸殘基取代原有的氨基酸殘基；

（c）獲得黑麥草花粉過敏原突變體的基因片段，經酶切后，與表達載體連接，構建成突變型重組載體；

（d）按照權利要求5所述步驟（4）~（6）的方法，獲得高純度的重組突變蛋白。

7.權利要求1-6所述的重組黑麥草花粉過敏原或其突變體在制備藥物中的應用，該藥物用于治療變態反應性疾病并使對黑麥草花粉過敏原乃至其它類型過敏的患者產生免疫耐受；或者用來診斷變態反應性疾病或者判斷其它食品藥品的過敏原性的高低。

8.權利要求7中所述的藥物或診斷試劑，其特征在于它包含根據權利要求1~6中任意一項的重組過敏原，任選與藥用或者診斷試劑中可接受的賦形劑和/或載體，并且任選佐劑和/或偶聯劑組合。