[發明專利]一株嗜乙酰乙酸棒桿菌及其產丁二酸的方法

有效

• 申請號: 201210094742.6
• 申請日: 2012-03-31
• 公開（公告）號: CN102634474A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 鄭璞;于芳;楊倩
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12P7/46;C12R1/15
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一株嗜乙酰乙酸棒桿菌（Corynebacterium?acetoacidophilum）YF/Δldh，已于2012年2月29日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC?NO：M2012041，其特征為乳酸脫氫酶基因ldh缺失菌株。

2.根據權利要求1所述的ldh基因缺失菌株，其特征是使嗜乙酰乙酸棒桿菌缺失ldh基因的方法包括以下步驟：

（a）以嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC?13870基因組為模板，利用PCR法分別擴增ldh基因上、下游片斷，其中，上游片斷的引物SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2，下游片斷的引物SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4，再采用重疊PCR法，以SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.4為引物，以ldh基因上、下游片斷為摸板，將ldh基因上下游片斷連接起來，形成ldh基因缺失片段，ldh上游片段序列為SEQ?ID?No.5，ldh下游片段序列為SEQ?ID?No.6；

（b）將此ldh基因缺失片段插入載體pK19mobsacB，構建ldh基因敲除載體，命名為pK19mobsacB-Δldh；

（c）將構建的ldh基因敲除載體導入嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870，分別通過卡那抗性和蔗糖抗性篩選培養基的篩選，得到缺失ldh基因的嗜乙酰乙酸棒桿菌的克隆菌YF/Δldh。

3.一種利用嗜乙酰乙酸棒桿菌YF/Δldh生產丁二酸的方法，其特征是在好氧條件下，25-37℃培養12-48小時，然后將所得的菌體細胞轉入以葡萄糖為底物，碳酸鹽為二氧化碳供體的缺氧環境中，于25-37℃下繼續培養30-100小時。

4.根據權利要求3所述的嗜乙酰乙酸棒桿菌YF/Δldh生產丁二酸的方法，其特征是YF/Δldh的好氧條件，培養基組分為以g/L計：葡萄糖?20-60，尿素0.5-5，酵母膏0.1-5，酪蛋白1-10，(NH₄)₂SO₄?2-20，KH₂PO₄?0.1-1.5，K₂HPO_4?0.1-1.5，MgSO₄·7H₂O?0.1-1.5，MnSO₄·H₂O?0.0004-0.005，FeSO₄·7H₂O?0.001-0.06，硫胺素?0.00005-0.0005，生物素?0.00002-0.0005，pH?7.0～7.2。

5.根據權利要求3所述的嗜乙酰乙酸棒桿菌YF/Δldh生產丁二酸的方法，其特征是嗜乙酰乙酸棒桿菌YF/Δldh的缺氧環境，培養基組分為以g/L計：葡萄糖50-400，碳酸鹽30-500，KH₂PO₄?0.1-1.5，K₂HPO₄0.1-1.5，MgSO₄·7H₂O?0.1-1.5，MnSO₄·H₂O?0.0004-0.005，FeSO₄·7H₂O?0.001-0.06，硫胺素?0.00005-0.0005，生物素?0.00002-0.0005，pH?7.0～7.2。

6.根據權利要求3所述的嗜乙酰乙酸棒桿菌YF/Δldh生產丁二酸的方法，其特征是所述菌體細胞，是好氧培養后的菌體，或好氧培養后離心的菌泥制成的固定化細胞。