[發明專利]一株嗜乙酰乙酸棒桿菌及其產丁二酸的方法

有效

• 申請號: 201210094742.6
• 申請日: 2012-03-31
• 公開（公告）號: CN102634474A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 鄭璞;于芳;楊倩
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12P7/46;C12R1/15
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及利用基因工程技術構建嗜乙酰乙酸棒桿菌工程菌，以及利用該基因工程菌生產丁二酸，屬于生物工程技術領域。?

背景技術

丁二酸(butanedioic?acid)，又稱琥珀酸(succinic?acid)廣泛存在于動植物和微生物體內，是TCA循環的中間產物之一。因其最早從琥珀中分離得到而得名。丁二酸是工業上一種重要的四碳化合物，它作為有機合成原材料、中間產物或專用化學品廣泛應用于食品、醫藥、農藥、染料、香料、油漆、塑料和材料工業。?

目前，丁二酸的生產方法主要有化學合成法和生物法。以化學法獲得丁二酸，不僅要消耗大量不可再生的石化原料，且轉化率低，成本高，易污染環境。生物法能夠避免傳統化學方法中所使用石化原料的消耗，生產過程環境友好，而且還能夠固定CO₂，緩解溫室效應，為丁二酸的工業化生產開辟了一條新的途徑。目前微生物發酵法生產丁二酸研究所涉及的高產微生物，主要有天然產琥珀酸的微生物和一些基因工程菌，前者如琥珀酸厭氧螺菌（Anaerobiospirillum?succiniciproducens）、琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus?succinogenes）和琥珀酸曼氏桿菌（Mannheimia?succiniciproducens）。美國專利US5573931公開了一株琥珀酸放線桿菌130Z（ATCC?55618），在100g/L葡萄糖、80g/L碳酸鎂的培養基中產琥珀酸可達到80?g/L以上，但發酵過程大量使用鎂鹽增加了發酵的成本，當改用鈉鹽替代鎂鹽時，由于菌株對鈉離子的耐受能力有限，產酸顯著下降。許多學者報道了E.?coli基因工程發酵生產丁二酸的方法，如美國專利US5770435和中國專利CN1886516A提供含有PtsG，pflB，ldhA突變（即磷酸轉移酶系統、丙酮酸甲酸裂解酶系統和乳酸脫氫酶系統不作用）的E.?coli工程菌AEP111，在通氣培養6小時后，關閉通氣施加厭氧條件，發酵144小時，產琥珀酸鹽59.35?g/L，其發酵周期較長；中國專利CN1268972A公布了利用基因工程技術構建一種乙酸和乳酸形成途徑缺陷的E.?coli工程菌SS373，將好氧培養的SS373轉入厭氧條件培養，但產酸不高（僅2.7?g/L）；中國專利CN?101029316A公開了缺失丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶基因的coli工程菌NTN111，采用先好氧培養，后厭氧發酵的方法生產丁二酸，產量也較低，厭氧發酵?41小時產丁二酸為25g/L。另外，在谷氨酸棒桿菌生產琥珀酸研究方面，中國專利CN1989238A、CN1989239A和CN1389752A分別公布了用基因工程技術構建乙酰輔酶A水解酶活性降低、丙酮酸氧化酶活性降低和增強2-氧代戊二酸脫氫酶活性的棒桿菌突變株，但其操作過程較復雜；中國專利CN101084946A公布了以谷氨酸棒桿菌C.?glutamicum?ATCC?13032為出發菌株，對其進行誘變處理，篩選到一株不產乳酸且高產丁二酸的C.glutamicumCGMCC?No.3991，該菌厭氧發酵36?h，其丁二酸產量可達到35.8?g/L，但其缺點仍是產量不高。?

本發明針對上述微生物發酵生產丁二酸存在的缺陷，基于嗜乙酰乙酸棒桿菌在缺氧條件下，菌體不生長但能夠利用葡萄糖分泌大量的乳酸，而在補充碳酸鹽條件下，又能同時分泌丁二酸的特點（生物加工過程，2011,?9:22-26），提供了一株不產生副產物L-乳酸的新的丁二酸生產菌株，在一定程度上有效地克服了上述微生物發酵生產丁二酸存在的缺陷，具有產琥珀酸濃度較高，生產周期短，易操作的特點。?

發明內容

本發明的目的是提供一株嗜乙酰乙酸棒桿菌及其產丁二酸的方法，所要解決的技術問題是提供一株高產丁二酸又不產生副產物L-乳酸的嗜乙酰乙酸棒桿菌，以及利用其生產丁二酸的方法。?