[發明專利]一種通過環化方式構建測序文庫的方法

有效

• 申請號: 201210093505.8
• 申請日: 2012-03-31
• 公開（公告）號: CN102628079A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發明（設計）人: 盛司潼
• 申請（專利權）人: 盛司潼
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/06;C40B50/06;C12N15/10
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因工程領域，更具體地說，涉及一種通過環化方式構建測序文庫的方法。

背景技術

過去幾年間，第二代高通量測序技術取得了突飛猛進的發展。其中，基于連接酶來實現測序的方法具有準確率高的優點，但由于其單一讀長短，限制了這類測序方法的應用。針對這種情況，近些年出現了通過構建具有特殊結構的測序文庫來提高測序讀長的方法，即在待測片段中插入一個或多個接頭序列，從而使同一測序文庫分子具有多個連接測序起始的位點，然后分別在這些不同的起始位點上進行連接測序，從而增加測序讀長。這種方法的核心在于，如何實現在待測片段中定向插入一個或多個接頭序列。

現有技術中是通過多次環化、酶切來實現的，其大致實現過程如下：1)將待測片段與第一接頭連接，所述第一接頭包含限制酶的結合位點；2)環化來自步驟1)的產物以產生第一環形多核苷酸；3)用限制酶切割第一環形多核苷酸；4)連接第二接頭，所述第二接頭包含限制酶的結合位點；5)環化來自步驟4)的產物以產生第二環形多核苷酸；重復步驟3)到5)以在待測片段中插入多個接頭。但是該方法對待測片段的大小均有一定的要求，如果待測片段過短，將降低環化的效率，甚至不能環化，或者環化后得到的是非目標產物，從而使得測序文庫構建失敗。即，現有技術中構建具有特殊結構的測序文庫的方法，要求用于構建測序文庫的原材料(源核酸)大于150bp，而且當建庫方法中還包括片段化步驟時，原材料的大小還要進一步加大，一般要求原材料與片段化產物的大小比在10∶1以上，才能保證經片段化步驟后得到的片段化產物的隨機性，進而保證后續測序結果的準確性。

由上可知，現有技術在構建上述具有特殊結構的測序文庫時，很大程度上局限于原材料的大小，無法對小片段核酸分子通過環化方式完成文庫構建，使得現有技術的實際應用范圍較窄。

因此需要一種新的通過環化方式構建測序文庫的方法，能夠突破對原材料大小的局限性，擴大測序文庫構建方法的適用范圍，并能進一步保證測序文庫構建過程中環化的效率。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新的通過環化方式構建測序文庫的方法，旨在解決現有技術在構建測序文庫時對原材料的大小具有較強的局限性，無法采用環化方式對小片段核酸分子進行測序文庫構建的問題。

為了實現發明目的，本發明提供了一種通過環化方式構建測序文庫的方法，包括下述步驟：

A.將核酸片段與連接組件連接，并以不增加其大小的形式進行環化，得到第一環形分子；所述連接組件含有至少一個酶切識別位點；

B.基于步驟A所述酶切識別位點，利用內切酶對第一環形分子中的核酸片段進行酶切，并將酶切產物與橋聯組件連接并環化，得到橋聯環化物。

其中，所述連接組件與核酸片段的大小比值大于等于4，即連接組件的大小至少是核酸片段的4倍。

其中，所述連接組件的大小大于等于140bp；更優選的，所述連接組件的大小大于等于400bp。

上述任一方案中，所述連接組件包括接頭和橋序列，所述接頭和/或橋序列含有IIs型限制性內切酶識別位點。

其中，所述步驟A包括以下步驟：

A1.將核酸片段與接頭連接，得到含接頭的核酸片段；

A2.將含接頭的核酸片段與橋序列連接并環化，得到第一環行分子。

進一步的，所述接頭包括第一接頭和第二接頭，所述第一接頭含有IIs型限制性內切酶識別位點，所述步驟A1包括以下步驟：

A11.將核酸片段與第一接頭連接，得到含第一接頭的核酸片段；

A12.利用IIs型限制性內切酶酶切含第一接頭的核酸片段，得到含第一接頭的酶切產物；

A13.將含第一接頭的酶切產物與第二接頭連接，得到含接頭的核酸片段。

更進一步的，所述步驟A11包括以下步驟：

A111.對核酸片段進行處理，得到處理過的核酸片段；所述處理方法包括去磷酸化、末端補平、加A尾、加polyA尾中的至少一種；

A112.將處理過的核酸片段與第一接頭連接，得到含第一接頭的核酸片段。

其中，所述步驟A2包括以下步驟：

A21.利用特異性切割劑分別對含接頭的核酸片段和橋序列進行切割，得到相對應的切割產物；

A22.利用連接酶，將相對應的切割產物連接并環化，得到第一環形分子；

所述接頭和橋序列均含有用于切割的識別位點；

所述特異性切割劑能夠特異性的識別接頭和橋序列的用于切割的識別位點，并對接頭、橋序列進行切割。