[發明專利]一種通過環化方式構建測序文庫的方法

有效

• 申請號: 201210093505.8
• 申請日: 2012-03-31
• 公開（公告）號: CN102628079A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發明（設計）人: 盛司潼
• 申請（專利權）人: 盛司潼
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/06;C40B50/06;C12N15/10
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1.一種通過環化方式構建測序文庫的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A.將核酸片段與連接組件連接，并以不增加其大小的形式進行環化，得到第一環形分子；所述連接組件含有至少一個酶切識別位點；

B.基于步驟A所述酶切識別位點，利用內切酶對第一環形分子中的核酸片段進行酶切，并將酶切產物與橋聯組件連接并環化，得到橋聯環化物。

2.根據權利要求1所述的通過環化方式構建測序文庫的方法，其特征在于，所述連接組件與核酸片段的大小比值大于等于4。

3.根據權利要求1所述的通過環化方式構建測序文庫的方法，其特征在于，所述連接組件的大小大于等于140bp。

4.根據權利要求3所述的通過環化方式構建測序文庫的方法，其特征在于，所述連接組件的大小大于等于400bp。

5.根據權利要求1所述的通過環化方式構建測序文庫的方法，其特征在于，所述連接組件包括接頭和橋序列，所述接頭和/或橋序列含有IIs型限制性內切酶識別位點。

6.根據權利要求5所述的通過環化方式構建測序文庫的方法，其特征在于，所述步驟A包括以下步驟：

A1.將核酸片段與接頭連接，得到含接頭的核酸片段；

A2.將含接頭的核酸片段與橋序列連接并環化，得到第一環行分子。

7.根據權利要求6所述的通過環化方式構建測序文庫的方法，其特征在于，所述接頭包括第一接頭和第二接頭，所述第一接頭含有IIs型限制性內切酶識別位點，所述步驟A1包括以下步驟：

A11.將核酸片段與第一接頭連接，得到含第一接頭的核酸片段；

A12.利用IIs型限制性內切酶酶切含第一接頭的核酸片段，得到含第一接頭的酶切產物；

A13.將含第一接頭的酶切產物與第二接頭連接，得到含接頭的核酸片段。

8.根據權利要求7所述的通過環化方式構建測序文庫的方法，其特征在于，所述步驟A11包括以下步驟：

A111.對核酸片段進行處理，得到處理過的核酸片段；所述處理方法包括去磷酸化、末端補平、加A尾、加poly?A尾中的至少一種；

A112.將處理過的核酸片段與第一接頭連接，得到含第一接頭的核酸片段。

9.根據權利要求6所述的通過環化方式構建測序文庫的方法，其特征在于，所述步驟A2包括以下步驟：

A21.利用特異性切割劑分別對含接頭的核酸片段和橋序列進行切割，得到相對應的切割產物；

A22.利用連接酶，將相對應的切割產物連接并環化，得到第一環形分子；

所述接頭和橋序列均含有用于切割的識別位點；

所述特異性切割劑能夠特異性的識別接頭和橋序列的用于切割的識別位點，并對接頭、橋序列進行切割。

10.根據權利要求1所述的通過環化方式構建測序文庫的方法，其特征在于，所述連接組件含有至少2個IIs限制性內切酶識別位點，所述步驟B具體為：

利用連接組件含有的IIs限制性內切酶識別位點，通過相應的限制性內切酶，對第一環行分子中的核酸片段中對應的兩個酶切位點進行切割，并將酶切產物與橋聯組件連接并環化，得到橋聯環化物。

11.根據權利要求1至10中任一項所述的通過環化方式構建測序文庫的方法，其特征在于，在步驟B之后還包括以下步驟：

C.更換內切酶和橋聯組件，對步驟B得到的橋聯環化物進行酶切、連接和環化，以在核酸片段中插入至少二個橋聯組件，得到環形測序文庫。

12.根據權利要求11所述的通過環化方式構建測序文庫的方法，其特征在于，所述橋聯組件含有IIs型限制性內切酶識別位點。