[發明專利]一種檢測甲型副傷寒沙門菌的RT-LAMP試劑盒

有效

• 申請號: 201210093342.3
• 申請日: 2012-03-31
• 公開（公告）號: CN102643901A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 閆梅英;樊粉霞;闞飆
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體的說涉及一種檢測甲型副傷寒沙門菌的逆轉錄-環介導等溫擴增技術(RT-LAMP)試劑盒。

背景技術

甲型副傷寒沙門菌(S.Paratyphi?A)是引起甲型副傷寒的病原菌，甲型副傷寒與傷寒在臨床癥狀上非常相似，難以區分，均以急起高熱為主要癥狀，是一種急性全身系統性傳染病。該病傳染性強，病程長，可反復發作，患者需住院隔離治療，是我國《傳染病防治法》中規定報告的乙類傳染病之一，也是全球特別是發展中國家共同面臨的公共衛生問題。

目前，甲型副傷寒沙門菌的傳統檢測方法為血分離培養及血清學診斷。血分離培養需時較長，約3-5天，且檢出率易受病程，采血量及患者是否服用抗生素等因素的影響，難以達到快速的要求；血清學診斷存在特異性、準確性差的問題，臨床上，單憑癥狀難以區分傷寒和副傷寒。因此有必要開發靈敏的早期檢測方法。目前，隨著抗生素的廣泛應用和病原體本身耐藥、變異等諸多因素的影響，近年甲型副傷寒的復發率增高，臨床表現很不典型，給早期臨床診斷和治療帶來很大的困難。

隨著分子生物學的發展，目前已有多種PCR方法用于甲型副傷寒沙門菌的檢測，雖在靈敏度方面有所改進，但由于需要精密儀器的配套使用，同樣也無法滿足基層和現場檢測的需求。

環介導等溫核酸擴增技術(loop-mediated?isotherm?amplification，LAMP)是由Notomi于2000年開發的一種新型的恒溫核酸擴增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNA?polymerase)和兩對特殊的引物，特異地識別靶序列上的6個獨立區域，在等溫條件下(65℃左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。

近年來，國外已將該技術廣泛應用于病原體檢測。Hong?TC等人(2004)根據LAMP的原理設計了實時定量RT-LAMP方法，以快速檢測SARS-CoV，結果RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍；Masaki?Imai等人(2007)建立了快速診斷H5N1禽流感病毒的RT-LAMP檢測體系。

LAMP還可以檢測細菌、真菌等病原微生物，其靈敏度和特異性都有很好的體驗。但目前尚未見該方法在甲型副傷寒沙門菌檢測中的應用。

發明內容

本發明的目的是提供用于檢測甲型副傷寒沙門菌(S.Paratyphi?A)的特異性RT-LAMP引物組。

本發明另一目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、操作簡單的LAMP檢測試劑盒。

為實現上述目的，通過對分離到的48株甲型副傷寒沙門菌hsdM基因和NCBI已報道的hsdM基因序列比對，通過BLAST軟件進行序列同源性分析，找到特異性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQ?IDNO.7所示。此外，本領域技術人員應當理解，該序列的特異性片段也可以作為檢測甲型副傷寒沙門菌的靶序列。

進一步，本發明還提供用于特異性擴增上述靶序列的引物組合。

本發明提供用于檢測甲型副傷寒沙門菌的特異性RT-LAMP引物組合，包括以下6條引物：

F3：5’-CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’；

B3：5’-GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’；

FIP：5’-CCAATAGAAATCCTCGGCCAG-

?????CCGAGTTTTGATAAGGATGATTG-3’；

RIP：5’-A?ACCCTTCAAAACTACCAAGTCC-

????GAATCTTTAACACGCAACTTTC-3’；

LF：5’-TGAGGTTGGATTCCAT-3’

LB：5’-ATTGAGTGGGTTAACAAA-3’

本發明提供了上述引物組在制備甲型副傷寒沙門菌的檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。

本發明提供了一種含有上述6條引物的檢測試劑。

本發明提供了一種含有上述6條引物的甲型副傷寒沙門菌的RT-LAMP檢測試劑盒。