[發(fā)明專利]磷硫酰化DNA的酶促合成方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210091733.1
• 申請日: 2012-03-31
• 公開（公告）號: CN102899316A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 由德林;曹博;鄧子新;鄭曉青
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/42
• 代理公司: 上海漢聲知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA分子的磷硫酰化修飾，具體涉及一種用于DNA分子磷硫酰化修飾的酶促合成方法。

背景技術(shù)

磷硫酰化修飾的DNA可以抵抗多種DNA水解酶的作用，因此在基因治療和分子生物學(xué)研究，如基因阻斷、定點突變等方面具有廣泛的應(yīng)用。目前對DNA進(jìn)行磷硫酰化修飾需要化學(xué)合成的方法實現(xiàn)，但是化學(xué)法具有多種局限性，如催化效率不高，只能合成短鏈并且磷硫酰化DNA是兩種旋光異構(gòu)體的混合物，純化分離步驟復(fù)雜等。而利用酶學(xué)方法進(jìn)行DNA磷硫酰化修飾除了可以解決化學(xué)合成中遇到的問題，還具有多方面的優(yōu)勢，如可以對不同長度和不同來源的DNA進(jìn)行可控的修飾，并且具有序列特異性和空間構(gòu)象特異性。

目前，發(fā)現(xiàn)在諸多微生物中存在能夠?qū)NA進(jìn)行磷硫酰化修飾的基因簇。利用基因克隆、異源表達(dá)和蛋白質(zhì)純化等技術(shù)，完成了利用沙門氏菌(Salmonella?enterica)serovar?Cerro?87中的磷硫酰化修飾系統(tǒng)進(jìn)行體外催化合成磷硫酰化的DNA。該催化體系包括兩種方式進(jìn)行：分別利用全細(xì)胞裂解液和純化的負(fù)責(zé)修飾的蛋白作為催化劑，進(jìn)行了30bp和4Mb不同長度的DNA的磷硫酰化修飾。利用LC-MS技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，兩種長度的DNA都成功的被磷硫酰化修飾，并且該修飾具有序列特異性和單一的R構(gòu)型。

因此，對不同生物來源的DNA磷硫酰化催化體系的開發(fā)，可以合成不同序列特異性和任意長度的磷硫酰化DNA。在此基礎(chǔ)上通過微生物發(fā)酵或者酶工程的方法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)磷硫酰化修飾的DNA分子，用于基因治療藥物、基因疫苗、或者分子生物學(xué)研究等領(lǐng)域。現(xiàn)有技術(shù)未發(fā)現(xiàn)利用酶學(xué)方法對DNA進(jìn)行磷硫酰化修飾的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種利用生物催化方法對DNA進(jìn)行磷硫酰化修飾。本發(fā)明提供的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對不同長度和不同來源的DNA進(jìn)行可控的修飾，并且具有序列特異性和空間構(gòu)象特異性，可用于分子生物學(xué)研究、基因治療、基因疫苗等諸多領(lǐng)域。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明涉及一種磷硫酰化DNA的酶促合成方法，該方法包括以下步驟：

以DNA和L-半胱氨酸為底物，加入DNA磷硫酰化修飾酶蛋白或者含有DNA磷硫酰化修飾酶蛋白的全細(xì)胞裂解液，在合適條件下發(fā)生磷硫酰化修飾酶促反應(yīng)，獲得磷硫酰化修飾的DNA。

優(yōu)選地，所述全細(xì)胞裂解液的制備包括如下步驟：接種沙門氏菌(Salmonella?enterica)serovar?Cerro?87至LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，收集菌體，用磷酸緩沖液洗滌所述菌體，用反應(yīng)緩沖液重懸，凍融，超聲破碎所述菌體，離心，取上清液，即獲所述全細(xì)胞裂解液。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液包括20mM?Tris-HCl、60mM?KCl、10mM?MgCl₂、1mM?EDTA、2mM?DTT、1mM?PMSF和體積比為25％的甘油，所述反應(yīng)緩沖液的pH為8.0。

優(yōu)選地，所述酶促反應(yīng)包括如下步驟：制備短鏈DNA-鏈霉親和素復(fù)合體，向所述DNA-鏈霉親和素復(fù)合體中加入所述全細(xì)胞裂解液，再加入終濃度為1mM的ATP、0.1mM的PLP和0.1mM的Cys，常規(guī)條件下反應(yīng)，離心終止反應(yīng)，用磷酸緩沖液洗滌反應(yīng)物。

優(yōu)選地，所述DNA磷硫酰化修飾酶蛋白的制備包括如下步驟：從沙門氏菌克隆DNA磷硫酰化修飾的酶蛋白基因，構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)，裂解，鎳柱親和純化，F(xiàn)PLC純化，蛋白濃縮，即得所述DNA磷硫酰化修飾酶蛋白。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述沙門氏菌為沙門氏菌(Salmonella?enterica)serovar?Cerro87。

優(yōu)選地，所述酶促反應(yīng)包括如下步驟：取基因組DNA和所述DNA磷硫酰化修飾酶蛋白置于反應(yīng)緩沖液，并加入終濃度為1mM的ATP、0.1mM的PLP和0.1mM的Cys，30℃下進(jìn)行反應(yīng)，加入苯酚氯仿抽提，抽提后的上清加入異丙醇沉淀，洗滌，干燥，即獲磷硫酰化修飾的DNA。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液包括20mM的Tris-HCl和10mM的MgCl₂，所述反應(yīng)緩沖液的pH為8.0。

優(yōu)選地，所述各酶蛋白的重量份相同。

優(yōu)選地，所述DNA的鏈長為30bp或4Mbp。