[發(fā)明專利]磷硫酰化DNA的酶促合成方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210091733.1
• 申請(qǐng)日: 2012-03-31
• 公開（公告）號(hào): CN102899316A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 由德林;曹博;鄧子新;鄭曉青
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12R1/42
• 代理公司: 上海漢聲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國(guó)中

1.一種磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，包括如下步驟：以DNA和L-半胱氨酸為底物，加入DNA磷硫酰化修飾酶蛋白或者含有DNA磷硫酰化修飾酶蛋白的全細(xì)胞裂解液，在合適條件下發(fā)生磷硫酰化修飾酶促反應(yīng)，獲得磷硫酰化修飾的DNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述全細(xì)胞裂解液的制備包括如下步驟：接種沙門氏菌(Salmonella?enterica)serovar?Cerro?87至LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，收集菌體，用磷酸緩沖液洗滌所述菌體，用反應(yīng)緩沖液重懸，凍融，超聲破碎所述菌體，離心，取上清液，即獲所述全細(xì)胞裂解液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述反應(yīng)緩沖液包括20mM?Tris-HCl、60mM?KCl、10mM?MgCl₂、1mM?EDTA、2mM?DTT、1mM?PMSF和體積比為25％的甘油，所述反應(yīng)緩沖液的pH為8.0。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述酶促反應(yīng)包括如下步驟：制備短鏈DNA-鏈霉親和素復(fù)合體，向所述DNA-鏈霉親和素復(fù)合體中加入所述全細(xì)胞裂解液，再加入終濃度為1mM的ATP、0.1mM的PLP和0.1mM的Cys，常規(guī)條件下反應(yīng)，離心終止反應(yīng)，用磷酸緩沖液洗滌反應(yīng)物。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述DNA磷硫酰化修飾酶蛋白的制備包括如下步驟：從沙門氏菌克隆DNA磷硫酰化修飾的酶蛋白基因，構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)，裂解，鎳柱親和純化，F(xiàn)PLC純化，蛋白濃縮，即得所述DNA磷硫酰化修飾酶蛋白。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述沙門氏菌為沙門氏菌(Salmonella?enterica)serovar?Cerro?87。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述酶促反應(yīng)包括如下步驟：取基因組DNA和所述DNA磷硫酰化修飾酶蛋白置于反應(yīng)緩沖液，并加入終濃度為1mM的ATP、0.1mM的PLP和0.1mM的Cys，30℃下進(jìn)行反應(yīng)，加入苯酚氯仿抽提，抽提后的上清加入異丙醇沉淀，洗滌，干燥，即獲磷硫酰化修飾的DNA。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述反應(yīng)緩沖液包括20mM的Tris-HCl和10mM的MgCl₂，所述反應(yīng)緩沖液的pH為8.0。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述各酶蛋白的重量份相同。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，所述DNA的鏈長(zhǎng)為30bp或4Mbp。