[發明專利]介導整合的HIV?1前病毒基因敲除的鋅指核酸內切酶及其制法和應用

有效

• 申請號: 201210091063.3
• 申請日: 2012-03-30
• 公開（公告）號: CN103361328B
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 朱煥章;曲喜英;王鵬飛
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/11;A61K38/46;A61K48/00;A61P31/18
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司31266
• 代理人: 祝蓮君,雷芳

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地，本發明涉及介導整合的HIV-1前病毒基因敲除的鋅指核酸內切酶及其制法和應用。

背景技術

獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是由HIV感染引起的一種嚴重危害人們生命健康的傳染性疾病。據WHO統計，全球艾滋病患者己超過5000萬，每年新增患者500萬，而每年死于艾滋病的人數約為300萬。

目前，艾滋病臨床治療方法主要是高效抗逆傳錄病毒療法(Highly active antiretroviral therapy，HAART)，該療法不僅控制HIV復制，并且能重建AIDS患者的免疫功能，為AIDS的治療打開了希望之門。但該療法僅能抑制病毒復制，不能徹底清除病毒，其原因在于HIV感染細胞后，即可整合在宿主靶細胞染色體上形成前病毒(provirus)，并能隨染色體的復制而遺傳，不僅為病毒轉錄提供穩定模板，也為其逃脫機體免疫系統及藥物攻擊提供了避風港。

如何靶向清除整合在宿主靶細胞染色體上的HIV前病毒是目前HIV/AIDS治療研究領域最富有挑戰性、亟待解決的重大科學問題。目前本領域還沒有針對該問題的有效手段，因此，本領域迫切需要開發一種定向清除靶細胞染色體上的HIV前病毒的方法，從而從根本上解決HIV/AIDS的治療問題。

發明內容

本發明的目的就是提供一種介導整合HIV-1前病毒基因敲除的鋅指核酸內切酶及其制法和應用。

在本發明的第一方面，提供了一種鋅指核酸內切酶，所述的鋅指核酸內切酶特異性地識別并切割整合于宿主染色體的HIV前病毒。

在另一優選例中，所述的宿主為人或非人哺乳動物細胞。

在另一優選例中，所述的鋅指核酸內切酶為單體形式或二聚體形式，其中所述二聚體由二個鋅指核酸內切酶單體所構成；較佳地所述的二聚體是異二聚體。

在另一優選例中，所述單體包括單體1和單體2，每個單體都具有識別元件和切割元件，并且所述單體1的識別元件識別HIV前病毒SEQ ID NO.：2所示的序列，所述單體2的識別元件識別HIV前病毒SEQ ID NO.：3所示的序列。

在另一優選例中，單體1的識別元件具有如SEQ ID NO.：10所示的氨基酸序列，和/或單體1的切割元件具有如SEQ ID NO.：6所示的氨基酸序列；和/或

單體2的識別元件具有如SEQ ID NO.：11所示的氨基酸序列，和/或單體2的切割元件具有如SEQ ID NO.：7所示的氨基酸序列。

在另一優選例中，所述鋅指核酸內切酶的單體還包括連接識別元件和切割元件的肽接頭。

在另一優選例中，所述肽接頭的長度為1-30個氨基酸殘基，較佳地2-15個氨基酸殘基，更佳地3-5個氨基酸殘基。

在另一優選例中，所述的鋅指核酸內切酶單體1和單體2是相同的或不同的。

在另一優選例中，在另一優選例中，所述的鋅指核酸內切酶是異二聚體，所述的異二聚體能特異識別并切割整合于宿主基因組上的HIV前病毒的5′-LTR和3′-LTR序列。

在本發明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發明第一方面所述的鋅指核酸內切酶。

在本發明的第三方面，提供了一種載體，它含有本發明的第二方面所述的多核苷酸。

在另一優選例中，所述的載體還含有編碼3Flag肽的核苷酸序列和/或編碼核定位信號的核苷酸序列。

在另一優選例中，所述的載體為pUC表達質粒。

在另一優選例中，所述的載體具有如SEQ ID NO.：4或SEQ ID NO.：5所示的序列。

在本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有本發明的第三方面所述的載體或基因組中整合有本發明的第二方面所述的多核苷酸。

在另一優選例中，所述宿主細胞為真核細胞，較佳地，所述宿主細胞為：Jurkat細胞、CHO細胞、COS細胞、293T細胞、RSF細胞等，更佳地為HIV感染的Jurkat細胞(較佳地HIV-1感染的Jurkat細胞)、293T細胞、T淋巴細胞、單核細胞、巨嗜細胞、少突膠質細胞，造血干細胞，樹突狀細胞。

在本發明的第五方面，提供了一種產生本發明第一方面所述鋅指核酸內切酶的方法，包括步驟：

在適合表達的條件下，培養本發明的第四方面所述的宿主細胞，從而表達出第一方面所述的鋅指核酸內切酶；和分離所述鋅指核酸內切酶。