[發明專利]介導整合的HIV?1前病毒基因敲除的鋅指核酸內切酶及其制法和應用

有效

• 申請號: 201210091063.3
• 申請日: 2012-03-30
• 公開（公告）號: CN103361328B
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 朱煥章;曲喜英;王鵬飛
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/11;A61K38/46;A61K48/00;A61P31/18
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司31266
• 代理人: 祝蓮君,雷芳

1.一種鋅指核酸內切酶，其特征在于，所述的鋅指核酸內切酶特異性地識別并切割整合于宿主染色體的HIV前病毒；

所述的鋅指核酸內切酶為單體形式或二聚體形式，其中所述二聚體由二個鋅指核酸內切酶單體所構成；

所述單體包括單體1和單體2，每個單體都具有識別元件和切割元件，并且所述單體1的識別元件識別HIV前病毒SEQ ID NO.2所示的序列，所述單體2的識別元件識別HIV前病毒SEQ ID NO.3所示的序列

單體1的識別元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，和/或單體1的切割元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；和/或

單體2的識別元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，和/或單體2的切割元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.如權利要求1所述的鋅指核酸內切酶，其特征在于，所述的宿主為人或非人哺乳動物細胞。

3.如權利要求1所述的鋅指核酸內切酶，其特征在于，所述的二聚體是異二聚體。

4.如權利要求1所述的鋅指核酸內切酶，其特征在于，所述鋅指核酸內切酶的單體還包括連接識別元件和切割元件的肽接頭。

5.如權利要求4所述的鋅指核酸內切酶，其特征在于，所述肽接頭的長度為1-30個氨基酸殘基。

6.如權利要求5所述的鋅指核酸內切酶，其特征在于，所述肽接頭的長度為2-15個氨基酸殘基。

7.如權利要求6所述的鋅指核酸內切酶，其特征在于，所述肽接頭的長度為3-5個氨基酸殘基。

8.如權利要求1所述的鋅指核酸內切酶，其特征在于，所述的鋅指核酸內切酶單體1和單體2是相同的或不同的。

9.如權利要求4所述的鋅指核酸內切酶，其特征在于，所述的鋅指核酸內切酶是異二聚體，所述的異二聚體能特異識別并切割整合于宿主基因組上的HIV前病毒的5′-LTR和3′-LTR序列。

10.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼權利要求1所述的鋅指核酸內切酶。

11.一種載體，其特征在于，它含有權利要求10所述的多核苷酸。

12.如權利要求11所述的載體，其特征在于，所述的載體還含有編碼3Flag肽的核苷酸序列和/或編碼核定位信號的核苷酸序列。

13.如權利要求11所述的載體，其特征在于，所述的載體為pUC表達質粒。

14.如權利要求11所述的載體，其特征在于，所述的載體具有如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的序列。

15.一種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞含有權利要求11所述的載體或基因組中整合有權利要求10所述的多核苷酸。

16.如權利要求15所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為真核細胞。

17.如權利要求15所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為：Jurkat細胞、CHO細胞、COS細胞、293T細胞、或RSF細胞。

18.如權利要求16所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為HIV感染的Jurkat細胞、293T細胞、T淋巴細胞、單核細胞、巨嗜細胞、少突膠質細胞，造血干細胞，或樹突狀細胞。

19.如權利要求18所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為HIV-1感染的Jurkat細胞。

20.一種產生權利要求1所述鋅指核酸內切酶的方法，其特征在于，包括步驟：在適合表達的條件下，培養權利要求15所述的宿主細胞，從而表達出權利要求1所述的鋅指核酸內切酶；和分離所述鋅指核酸內切酶。

21.權利要求1所述的鋅指核酸內切酶的用途，其特征在于，用于制備：

(a)治療艾滋病的藥物，或

(b)切割整合于宿主染色體的HIV前病毒的組合物。