[發明專利]一種膜培養篩選鳥苷高產菌的方法

無效

• 申請號: 201210090866.7
• 申請日: 2012-03-31
• 公開（公告）號: CN102757898A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 程波;戶業麗
• 申請（專利權）人: 武漢工程大學
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體來說是一種鳥苷（Guanosine）高產菌篩選的方法。

背景技術

鳥苷又名鳥嘌呤核苷或9-(β-D-呋喃核糖基)鳥嘌呤（9-(β-D-Ribofuranosyl)?guanine?鳥嘌呤-9-β-D-呋喃核糖苷（Guanine-9-β-D-ribofuranoside）。鳥苷的用途十分廣泛，可用于合成食品增鮮劑—5’-鳥苷酸二鈉、呈味核苷酸二鈉以及作為醫藥產品的重要中間體，可形成一系列的下游醫藥產品，包括核苷類抗病毒藥物如利巴韋林、阿昔洛韋等，也是用于制造無環鳥苷(Acyclovir)、三氮唑核苷(ATC)、三磷酸鳥苷鈉(GTP)等藥物的主要原料。小西等人，通過解除IMP脫氫酶的反饋抑制，選育的抗8-氮鳥嘌呤等突變株，把肌苷生產株變為具有產鳥苷能力的突變株；松井等人由枯草芽孢桿菌為出發菌株，誘導具有甲硫氨酸亞砜突變株，進一步提高鳥苷的產量；Hiroshi?Matsui等人進一步篩選出具有阿洛酮糖素抗性和德夸菌素抗性的突變株，增大了鳥苷的積累。

????但由于鳥苷生產菌是缺陷性生產菌株，在保藏，生產，傳代過程中鳥苷高產菌株不可避免的發生負變，造成鳥苷的產量下降，必須進行定期的篩選和復壯。但傳統的稀釋涂平板法但從菌落形態上很難分辨出高產和負變菌株，初篩很盲目，增大了工作量，而準確度不高，造成篩選周期長，重復工作等弊病。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術而提出一種膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，該方法可以應用在鳥苷的大規模工業生產中，快速準確地進行鳥苷高產菌的篩選和復壯。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是：一種膜培養篩選鳥苷高產菌的方法，包括有以下步驟：

1）將待篩選和復壯的鳥苷生產菌加入滅菌蒸餾水，置振蕩器上，混合均勻，制成稀釋度為10^-2-10^-7的菌懸液；

2）將菌懸液接種至膜培養系統中，靜置培養；

3）根據膜培養系統中鳥苷生產菌的菌落大小和形態進行判斷，初篩出鳥苷高產菌株和負變菌株。

按上述方案，所述的膜培養系統由三部分組成，培養皿的底層為步驟1）所述的菌懸液混勻的營養成分不豐富的瓊脂培養基，中層為微孔濾膜，上層為浸潤了營養豐富的培養液的滅菌濾紙。

按上述方案，所述的微孔濾膜孔徑為0.02μm，直徑為ψ85mm的聚碳酸酯微孔濾膜。

按上述方案，所述的營養成分不豐富的瓊脂培養基為：雙酶糖30±5?g/L?，蛋白胨1±0.5?g/L?，磷酸二氫鉀4±0.5?g/L，硫酸銨6±2g/L，氯化鈉1±0.5?g/L，碳酸鈣20±5?g/L和硫酸鎂3±2?g/L。

按上述方案，所述的營養成分豐富的的培養液為：酵母粉35±5?g/L，酵母膏10±5?g/L和玉米漿10±2?g/L。

按上述方案，靜置培養條件為：28℃-38℃，培養時間為30?h-44?h。

按上述方案，膜培養系統的制備方法為：待培養皿的底層的營養成分不豐富的瓊脂培養基凝固，培養6?h-8?h后，在其上置一層滅菌的聚碳酸酯微孔濾膜，其上層再布置浸潤了營養豐富的培養液的滅菌濾紙，于28℃?-38℃繼續培養22?h-36?h。

按上述方案，步驟3）中的判斷方法是：膜培養系統中同樣條件下生長快，菌落大而潤澤的單菌落，為負變菌株，產苷量較低；生長較慢，菌落小而干燥的單菌落，為高產菌株。

按上述方案，初篩后還包括進一步復篩，通過將篩選出的高產菌株和負變菌株接入搖瓶，28℃-38℃，轉速200?rpm-300?rpm，培養30?h-48?h，取離心后，清液采用HPLC法，準確測定鳥苷的產量。

本發明的有益效果在于：通過此方法篩選到的鳥苷高產菌，搖瓶培養產苷達18-20?g/L。該方法新穎，實施簡便，篩選準確率遠高于傳統篩選方法，對于工廠高產菌株日常的分離，篩選工作起到了提高效率，增加準確率和減少工作量的優化作用。

附圖說明

圖1為膜培養系統的結構示意圖；

圖2為應用實施例1鳥苷甘油保藏菌膜培養法篩選結果；

圖3為應用實施例2鳥苷斜面保藏菌膜培養法篩選結果；

圖4為應用實施例3鳥苷發酵菌液膜培養法篩選結果；

圖5為應用實施例4鳥苷誘變后的菌株培養法篩選結果。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步詳細的說明，但是此說明不會構成對本發明的限制。