[發(fā)明專利]一種規(guī)模化擴增骨髓間充質(zhì)干細胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210090796.5
• 申請日: 2012-03-30
• 公開（公告）號: CN103361308A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周浪;郭美錦;張嗣良;儲炬;莊英萍
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/077
• 代理公司: 上海專利商標事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地；本發(fā)明涉及一種規(guī)模化制備骨髓間充質(zhì)干細胞的方法。

背景技術(shù)

存在于骨髓中的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone?marrow?Mesenchymal?Stem?Cells，bmMSCs)是一種成體干細胞，具有多向分化潛能，可以誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和神經(jīng)細胞等。由于可以進行自體移植，因此成為近年來的研究熱點。bmMSCs取材方便，易于體外擴增并長期保持多分化潛能，可進行自體移植而不存在組織配型和免疫排斥，被認為是組織工程中最佳的種子細胞。

骨髓間充質(zhì)干細胞用于臨床、組織工程需要大量的細胞，但是從骨髓中獲取的干細胞數(shù)量有限，不能滿足于組織工程所需的細胞量。由于骨髓間充質(zhì)干細胞需要貼壁生長，實驗室使用培養(yǎng)瓶擴增不但耗材消耗量大，而且時間的付出也多。生物反應(yīng)器通常用于大規(guī)模擴增細胞，能夠一次性獲得大量細胞，既節(jié)省了大量的耗材，又節(jié)省了很多時間。但是，本領(lǐng)域目前還沒有成功大規(guī)模擴增獲得骨髓間充質(zhì)干細胞的先例。

因此，本領(lǐng)域迫切需要研究骨髓間充質(zhì)干細胞的大規(guī)模擴增方法，以滿足科學研究以及臨床應(yīng)用所需。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種規(guī)模化擴增骨髓間充質(zhì)干細胞的方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，所述方法包括：

(1)將骨髓間充質(zhì)干細胞進行低血清馴化，獲得低血清馴化的骨髓間充質(zhì)干細胞；

(2)將步驟(1)獲得的低血清馴化的骨髓間充質(zhì)干細胞以2.3-2.7×10⁵細胞/ml(較佳地2.4-2.6×10⁵細胞/ml；更佳地2.5×10⁵細胞/ml)的細胞密度培養(yǎng)于血清濃度0.8-4％(v/v)(較佳地1-3％(v/v))的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中還加入密度為3.5-4.5mg/ml(更佳地為3.8-4.2mg/ml；更佳地為4mg/ml)的微載體cytodex3；培養(yǎng)4-10天；

(3)分離獲得骨髓間充質(zhì)干細胞。

在一個優(yōu)選例中，步驟(1)中，所述的低血清馴化的方法為：將骨髓間充質(zhì)干細胞依次加入到血清含量依次遞減的培養(yǎng)基中，使得骨髓間充質(zhì)干細胞適應(yīng)低血清環(huán)境。

在另一優(yōu)選例中，所述的低血清馴化方法為：

(a)將細胞以1×10⁵細胞/ml密度接種至10％(v/v)血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h，收獲接近90％匯合的細胞；

(b)細胞再以2×10⁵細胞/ml密度接種至7％(v/v)血清的培養(yǎng)基中，當細胞生長至接近90％匯合時，胰酶消化收獲細胞，并以相同的密度接種至7％血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

(c)等(b)的細胞再次生長至接近匯合時，將收獲的細胞重復(b)的流程依次接種至5％(v/v)、3％(v/v)、1％(v/v)血清的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，在起始培養(yǎng)的20-28小時(如24小時)內(nèi)，培養(yǎng)基中血清含量3±0.5％(v/v)；之后培養(yǎng)基中血清含量1±0.2％(v/v)(更佳地1±0.1％(v/v))。

在另一優(yōu)選例中，每隔0.5-2天(如1天)換培養(yǎng)基50％。

在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，在起始培養(yǎng)的前10-14小時(如11-13小時)，以半體積培養(yǎng)基培養(yǎng)，也即在該階段，培養(yǎng)基中細胞和微載體cytodex3處于倍增的密度，如細胞為4.6-5.4×10⁵細胞/ml；或微載體cytodex3為7-9mg/ml；在起始培養(yǎng)10-14小時之后，以全體積培養(yǎng)基培養(yǎng)，也即在該階段，細胞為2.3-2.7×10⁵細胞/ml；或微載體cytodex3為3.5-4.5mg/ml。

在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，前12小時進行間歇攪拌，3min/h；13-48小時以35rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)；49-96小時以45rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)；97小時及之后以50rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)；或

步驟(2)中，控制溶氧(DO)為40±10％(v/v)；或

步驟(2)中，控制pH值分別為與7.2±0.2。

在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基是DMEM/F12培養(yǎng)基。

在另一優(yōu)選例中，骨髓間充質(zhì)干細胞在10mL-100L(如100mL，1.5L，5L，10L，50L)的系統(tǒng)中培養(yǎng)。