[發(fā)明專利]一種規(guī)模化擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210090796.5
• 申請日: 2012-03-30
• 公開（公告）號: CN103361308A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周浪;郭美錦;張嗣良;儲炬;莊英萍
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/077
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行低血清馴化，獲得低血清馴化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；

(2)將步驟(1)獲得的低血清馴化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以2.3-2.7×10⁵細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度培養(yǎng)于血清濃度0.8-4％(v/v)的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中還加入密度為3.5-4.5mg/ml的微載體cytodex3；培養(yǎng)4-10天；

(3)分離獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的低血清馴化的方法為：將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞依次加入到血清含量依次遞減的培養(yǎng)基中，使得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞適應(yīng)低血清環(huán)境。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的低血清馴化方法為：

(a)將細(xì)胞以1×10⁵細(xì)胞/ml密度接種至10％(v/v)血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h，收獲接近90％匯合的細(xì)胞；

(b)細(xì)胞再以2×10⁵細(xì)胞/ml密度接種至7％(v/v)血清的培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞生長至接近90％匯合時(shí)，胰酶消化收獲細(xì)胞，并以相同的密度接種至7％血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

(c)等(b)的細(xì)胞再次生長至接近匯合時(shí)，將收獲的細(xì)胞重復(fù)(b)的流程依次接種至5％(v/v)、3％(v/v)、1％(v/v)血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，在起始培養(yǎng)的20-28小時(shí)內(nèi)，培養(yǎng)基中血清含量3±0.5％(v/v)；之后培養(yǎng)基中血清含量1±0.2％(v/v)。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，每隔0.5-2天換培養(yǎng)基50％。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，前12小時(shí)進(jìn)行間歇攪拌，3min/h；13-48小時(shí)以35rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)；49-96小時(shí)以45rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)；97小時(shí)及之后以50rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)；或

步驟(2)中，控制溶氧為40±10％(v/v)；或

步驟(2)中，控制pH值分別為與7.2±0.2。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基是DMEM/F12培養(yǎng)基。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，分離獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法為：從培養(yǎng)基中分離貼附了細(xì)胞的微載體cytodex3，洗滌，以胰蛋白酶消化，間歇震蕩以使細(xì)胞從微載體cytodex3脫落，分離去除微載體cytodex3。

9.一種制備成軟骨細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

(i)根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的方法獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；

(ii)將(i)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，從而獲得成軟骨細(xì)胞。

10.一種制備成骨細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

(i)根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的方法獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；

(ii)將(i)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，從而獲得成骨細(xì)胞。