[發明專利]一株脂多糖合成缺陷的無毒福氏志賀氏菌及其構建方法

無效

• 申請號: 201210089131.2
• 申請日: 2012-03-29
• 公開（公告）號: CN102851226A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 王恒樑;朱力;宋麗;馮爾玲;劉先凱
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/09;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一株脂多糖合成缺陷的無毒福氏志賀氏菌及其構建方法。

背景技術

志賀氏菌(Shigella?spp.)俗稱痢疾桿菌，作為一種具有高度傳染性革蘭氏陰性腸道致病菌，主要通過侵入人結腸上皮細胞最終定位于大腸，而引起典型細菌性痢疾(發熱、腹痛、里急后重、大便膿血)，而毒力大質粒則是其致病性的最主要的因素，包含有大概32個與毒力有關的基因，主要包括與III型分泌系統有關的mxi-spa基因，與細菌侵入上皮細胞密切相關的ipaBCD，以及ipgC等毒力基因。

志賀氏菌感染劑量極低(10-100個細菌)，2010年我國衛生部公布的全年法定報告傳染病疫情中，細菌性痢疾發病數位居第四，其中福氏2a型占到細菌性痢疾總數的50-70％，次于病毒性肝炎，肺結核和梅毒。目前治療痢疾的主要方式是抗生素，但不同菌群及血清型之間雖然無交叉免疫，但存在交叉抗藥性，加上臨床分離多重耐藥菌株的不斷增加，常規的抗生素治療遇到了巨大的挑戰；由于急性期治療不及時、對耐藥菌株用藥不當、治療不徹底等原因可導致急性菌痢轉變成慢性菌痢，故對細菌性痢疾的治療方式受到越來越嚴峻的挑戰。因此，開發針對細菌的多糖疫苗重新引起了人們的研究興趣。

在疫苗生產中，通常是使用的減毒(或無毒)病原菌(病毒)，所以需獲得無毒菌株，而志賀氏菌的毒力大質粒是其致病性的主要因素。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種重組菌A。

本發明提供的重組菌A，為去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因得到的重組菌。

上述福氏2a志賀氏菌為福氏2a志賀氏菌301，上述毒力大質粒為pCP301。

本發明的另一個目的是提供一種制備上述重組菌A的方法，包括如下步驟：去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因，得到重組菌A。

上述方法中，所述去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因為依次去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因。

上述方法中，所述去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒的方法包括如下步驟：

1)將與所述毒力大質粒不相容的質粒導入所述福氏2a志賀氏菌中，得到中間重組菌1(通過抗生素抗性篩選)；

2)去除所述中間重組菌1中的所述與毒力大質粒不相容的質粒，得到去除毒力大質粒的重組菌B；

所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因的方法包括如下步驟：

3)將抗性篩選標記物基因替換掉所述重組菌B基因組中的O-抗原連接酶基因，得到去除O-抗原連接酶基因的中間重組菌2；

4)去除所述中間重組菌2中的所述抗性篩選標記物基因，得到所述重組菌A。

上述方法中，步驟2)包括如下步驟：在40℃-42℃培養所述中間重組菌1，以去除其中的毒力大質粒，得到去除毒力大質粒的重組菌B；所述培養為至少培養3代，所述毒力大質粒為pCP301；

步驟3)包括如下步驟：先將含有編碼λ-Red重組系統所需酶的質粒導入所述重組菌B，得到中間重組菌3，再將含有所述抗性篩選標記物基因的DNA片段導入所述中間重組菌3中，得到中間重組菌4(通過抗生素抗性篩選)；再將所述中間重組菌4在40℃-42℃培養，得到中間重組菌2，所述培養為傳代至少2次，每次至少13小時；

步驟4)包括如下步驟：先將編碼FLP重組酶的質粒導入中間重組菌2中，得到中間重組菌5，再將所述中間重組菌5在40℃-42℃培養，得到所述重組菌A，其中，所述培養為連續培養2代，培養時間為至少12小時。

上述福氏2a志賀氏菌為福氏2a志賀氏菌301，上述毒力大質粒為pCP301。

上述方法中，步驟1)中，所述與毒力大質粒不相容的質粒為pKDinc；

步驟3)中，所述抗性篩選標記物基因為卡那霉素基因；

所述含有編碼λ-Red重組系統所需酶的質粒為質粒pKOBEG；

所述含有所述抗性篩選標記物基因的DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列1；

步驟4)中，所述編碼FLP重組酶的質粒為質粒pCP20。

上述方法中，步驟3)中，在所述再將含有所述抗性篩選標記物基因的DNA片段導入所述中間重組菌3中的步驟前還包括將所述中間重組菌3經L-阿拉伯糖誘導培養的步驟。