[發明專利]一株脂多糖合成缺陷的無毒福氏志賀氏菌及其構建方法

無效

• 申請號: 201210089131.2
• 申請日: 2012-03-29
• 公開（公告）號: CN102851226A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 王恒樑;朱力;宋麗;馮爾玲;劉先凱
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/09;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.一種重組菌A，為去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因得到的重組菌。

2.一種制備權利要求1所述的重組菌A的方法，包括如下步驟：去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因，得到重組菌A。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因為依次去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒和所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因。

4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于：

所述去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒的方法包括如下步驟：

1)將與所述毒力大質粒不相容的質粒導入所述福氏2a志賀氏菌中，得到中間重組菌1；

2)去除所述中間重組菌1中的所述與毒力大質粒不相容的質粒，得到去除毒力大質粒的重組菌B；

所述福氏2a志賀氏菌基因組中的O-抗原連接酶編碼基因的方法包括如下步驟：

3)將抗性篩選標記物基因替換掉所述重組菌B基因組中的O-抗原連接酶基因，得到去除O-抗原連接酶基因的中間重組菌2；

4)去除所述中間重組菌2中的所述抗性篩選標記物基因，得到所述重組菌A。

5.根據權利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：

步驟2)包括如下步驟：在40℃-42℃培養所述中間重組菌1，以去除其中的毒力大質粒，得到去除毒力大質粒的重組菌B；

步驟3)包括如下步驟：先將含有編碼λ-Red重組系統所需酶的質粒導入所述重組菌B，得到中間重組菌3，再將含有所述抗性篩選標記物基因的DNA片段導入所述中間重組菌3中，得到中間重組菌4；再將所述中間重組菌4在40℃-42℃培養，得到中間重組菌2；

步驟4)包括如下步驟：先將編碼FLP重組酶的質粒導入中間重組菌2中，得到中間重組菌5，再將所述中間重組菌5在40℃-42℃培養，得到所述重組菌A。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：

步驟1)中，所述與毒力大質粒不相容的質粒為pKDinc；

步驟3)中，所述抗性篩選標記物基因為卡那霉素基因；

所述含有編碼λ-Red重組系統所需酶的質粒為質粒pKOBEG；

所述含有所述抗性篩選標記物基因的DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列1；

步驟4)中，所述編碼FLP重組酶的質粒為質粒pCP20。

7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于：

步驟3)中，在所述再將含有所述抗性篩選標記物基因的DNA片段導入所述中間重組菌3中的步驟前還包括將所述中間重組菌3經L-阿拉伯糖誘導培養的步驟。

8.一種制備重組菌B的方法，包括如下步驟：去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒，得到重組菌B。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：所述去除福氏2a志賀氏菌中的毒力大質粒的方法包括如下步驟：

1)將與所述毒力大質粒不相容的質粒導入所述福氏2a志賀氏菌中，得到中間重組菌1，

2)去除所述中間重組菌1中的所述與毒力大質粒不相容的質粒，得到去除毒力大質粒的重組菌B；

步驟2)具體包括如下步驟：在40℃-42℃培養所述中間重組菌1，得到去除毒力大質粒的重組菌B；

所述與毒力大質粒不相容的質粒具體為pKDinc。

10.由權利要求8或9所述的方法制備得到的重組菌B；

或一種DNA分子，為如下(1)或(2)或(3)：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交的DNA分子；

(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的DNA分子。