[發明專利]一種重組胸腺肽α1的制備方法

有效

• 申請號: 201210086281.8
• 申請日: 2012-03-28
• 公開（公告）號: CN102660568A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 蔣為民;柴向東;丁佳萱;羅豪暉;趙秦;朱瑞東;韓杰;高琰
• 申請（專利權）人: 深圳市海王英特龍生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C07K14/575;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

技術領域

本發明涉及醫藥生物工程技術領域，具體涉及一種重組多肽的制備方法。

背景技術

胸腺肽α1是Goldstein等1977年首次在胸腺組織中發現的由28個氨基酸組成的多肽，天然胸腺肽α1的氨基酸序列為：NH₂-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH。胸腺肽α1具有免疫調節功能，是一種廣譜免疫調節劑，臨床上用于治療乙型肝炎、丙型肝炎及腫瘤等疾病。此外，還可以用作疫苗輔助制劑。

目前，胸腺肽α1的生產方法有化學合成法和基因工程法。化學合成法的成本高，使用有機溶劑多，易造成環境污染。基因工程法是通過構建能表達胸腺肽α1的工程菌株(如大腸桿菌、酵母菌等)，在發酵階段進行誘導表達，再經過純化工序而制得胸腺肽α1。中國專利(專利號ZL200410077749.2)公開了一種通過基因工程技術制備胸腺肽α1的方法，該方法在pTRX質粒的基礎上構建表達菌株，發酵中采用IPTG誘導工程菌表達，再采用親和層析、離子交換層析純化融合蛋白，腸激酶切釋放出胸腺肽α1，再通過親和層析和HPLC純化出胸腺肽α1。

但該方法存在成本高、無法大規模生產等問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種簡便、成本低、收率高且適用于大規模生產的重組胸腺肽α1的制備方法。

本發明利用基因重組技術制備重組胸腺肽α1，包括人工合成融合蛋白基因并將所述融合蛋白基因重組到載體質粒pet-22b中構建表達載體，將該表達載體轉化到宿主大腸桿菌中構建工程菌，將所述工程菌進行發酵并誘導融合蛋白表達，對表達產物進行純化制備后得到融合蛋白目標產物。

本發明的具體技術方案為：

一種重組胸腺肽α1的制備方法，包括以下步驟：

1)人工合成胸腺肽α1的融合蛋白基因全序列，如SEQ?ID?NO.1所示；

2)將合成的基因酶切后，重組到質粒pet-22b上構建表達載體，并將表達載體轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中構建工程菌；

3)將工程菌發酵培養，以乳糖作為誘導劑誘導融合蛋白表達；

4)將步驟3)的表達產物進行純化，制備重組胸腺肽α1。

其中，步驟3)所述的發酵培養包括：

3a)將步驟2)構建的工程菌于培養基中培養獲得活化的種子菌；

3b)將活化的種子菌進行高密度發酵培養，培養過程中加入補碳液和補氮液步驟4)所述的純化包括以下步驟：

4a)收集經發酵培養的工程菌，用超高壓均質機破碎，得細胞破碎液；

4b)用中空纖維濾膜過濾細胞破碎液，得濾液I；

4c)濾液I經親和層析后，再經超濾除去咪唑，得濾液II；

4d)用腸激酶水解濾液II后，用親和層析和HPLC純化出胸腺肽α1。

進一步地，上述濾液II在15～20℃條件下，用腸激酶水解16hr。在所述條件可以減少腸激酶對胸腺肽α1的非特異性切割，有效提高胸腺肽α1的產量。

本發明的制備方法適用于大規模的工業化生產，不但顯著提高了重組胸腺肽α1的產率，而且還具有制備工藝簡單、生產成本低等有益效果。

附圖說明

圖1是實施例5所得胸腺肽的純度和濃度的HPLC分析圖。

圖2是實施例6所得胸腺肽的純度和濃度的HPLC分析圖。

圖3是實施例8中腸激酶水解融合蛋白的SDS-PAGE分析圖；

其中，泳道1為胸腺肽α1對照品、泳道2-6的水解溫度分別為：25℃、20℃、18℃、15℃、12℃。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明重組胸腺肽α1的制備方法進行詳細描述。

表達載體的構建

【實施例1】

1、試劑和材料

載體質粒pet-22b購自美國MERK公司，大腸桿菌BL21(DE3)購自天根生化科技(北京)公司，融合蛋白基因的合成及質粒的測序委托生工生物工程(上海)有限公司合成，T4DNA連接酶、DNA限制性內切酶Nde?I和Not?I購自生工生物工程(上海)有限公司，膠回收試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。

2、方法

(1)融合蛋白基因