[發(fā)明專利]一種重組胸腺肽α1的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210086281.8
• 申請日: 2012-03-28
• 公開（公告）號: CN102660568A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣為民;柴向東;丁佳萱;羅豪暉;趙秦;朱瑞東;韓杰;高琰
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C07K14/575;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 北京律誠同業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

1.一種重組胸腺肽α1的制備方法，包括以下步驟：

1)人工合成胸腺肽α1的融合蛋白基因全序列，所述基因序列如SEQ?ID?NO.1所示；

2)將合成的基因酶切后，重組到質(zhì)粒pet-22b上構(gòu)建表達載體，并將表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中構(gòu)建工程菌；

3)將工程菌發(fā)酵培養(yǎng)，以乳糖作為誘導劑誘導融合蛋白表達；

4)將步驟3)獲得的表達產(chǎn)物按下述步驟進行純化，制備重組胸腺肽α1；

4a)收集經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的工程菌，懸浮菌體，用超高壓均質(zhì)機破碎，得細胞破碎液；

4b)用中空纖維濾膜過濾細胞破碎液，得濾液I；

4c)濾液I經(jīng)親和層析后，再經(jīng)超濾，得濾液II；

4d)用腸激酶水解濾液II后，用親和層析和HPLC純化出胸腺肽α1。

2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4)所述純化包括以下步驟：

4a)收集經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的工程菌，用10倍重量的50mM?Tris-HCl(pH?8.0)，0.5MNaCl，20mM咪唑溶液重新懸浮菌體，然后用超高壓均質(zhì)機破碎，得細胞破碎液；

4b)用孔徑0.1μm～0.65μm的中空纖維濾膜過濾細胞破碎液的上清液，并洗濾3～5倍體積得濾液I；

4c)用50mM?Tris-HCl(pH?8.0)，0.5M?NaCl，20mM咪唑的緩沖液平衡親和層析柱，將濾液I上柱，棄去穿透液，然后再以50mM?Tris-HCl(pH?7.0)，0.5M?NaCl，20mM咪唑的緩沖液平衡層析柱，以Tris-HCl(pH?7.0)，0.5M?NaCl，150mM咪唑的緩沖液洗脫，收集融合蛋白峰流出液，以截留分子量為5KD或10KD的超濾膜超濾除去流出液中的咪唑，并將其中的緩沖液置換為20mmol/LTris-HCl，pH8.0，20mM?NaCl的緩沖液，得濾液II；

4d)測定濾液II的蛋白質(zhì)濃度，以1μl腸激酶切割4mg融合蛋白的比例加入腸激酶，于15℃水解16小時，用50mM?Tris-HCl(pH?8.0)，0.5M?NaCl的緩沖液平衡親和層析柱，將融合蛋白水解液上柱，收集穿透液，并將其中的緩沖液置換成超純水，然后用HPLC純化出胸腺肽α1。

3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)所述發(fā)酵包括以下步驟：

3a)將步驟2)構(gòu)建的工程菌于培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得活化的種子菌；

3b)將活化的種子菌進行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入補碳液和補氮液，以鹽酸-氨水調(diào)節(jié)pH，加入乳糖誘導劑培養(yǎng)獲得含表達的胸腺肽α1的菌體；其中補碳液含葡萄糖、MgSO₄·7H₂O和甘油，補氮液含蛋白胨，酵母粉和硫酸銨。

4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟3b)包括：

i)向發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基，每升發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：蛋白胨11.43g，酵母粉14.3g，NaCl?8.57g，KH₂PO₄6.43g，K₂HPO₄7.14g，MgSO₄·7H₂O?1.71g，葡萄糖10g，按體積比1∶25向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入活化種子菌，另加入消泡劑，于37℃，pH7.0的條件下發(fā)酵；

ii)控制發(fā)酵過程的溶解氧濃度為30％～60％，轉(zhuǎn)速為300-800rpm，自動流加2N的HCl或氨水將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)至7.0；

iii)加入種子菌后3hr時至誘導前30min，連續(xù)向發(fā)酵罐加入補碳液，每升補碳液組成為：葡萄糖312.5g，MgSO₄·7H₂O?12.5g，甘油150g；

iv)加入種子菌后4hr至誘導完畢前1hr，連續(xù)向發(fā)酵罐加入補氮液，每升補氮液組成為：蛋白胨65g，酵母粉65g，硫酸銨65g；

v)加入種子菌后6hr一次性加入乳糖進行誘導，使乳糖終濃度為10mM，誘導4hr后收集菌體。