[發明專利]一種雙重病毒滅活制備破傷風人免疫球蛋白的方法

有效

• 申請號: 201210082835.7
• 申請日: 2012-03-26
• 公開（公告）號: CN102603891A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 呂獻忠;孔冬冬
• 申請（專利權）人: 新疆德源生物工程有限公司
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C07K16/06;C07K1/16;A61K39/40;A61P31/04
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 高松

技術領域

本發明涉及生物制品的制備方法，具體涉及一種雙重病毒滅活制備破傷風人免疫球蛋白的方法。

背景技術

破傷風人免疫球蛋白屬于血液制品，隨著血液制品在臨床上廣泛應用，如何保證血液制品的安全性、預防和控制經血液途徑傳播的疾病，已成為世界醫藥衛生界乃至整個社會普遍關注的焦點。目前雖然已有單位采用雙重病毒滅活制備破傷風人免疫球蛋白，但卻沒有對滅活過程中具體的參數如DV50納米膜除病毒過程中的蛋白溶液的濃度、濾速、壓力和過濾量、過濾前及過濾后濾膜的完整性和低pH孵放除病毒過程的中樣品的pH值、蛋白質濃度、糖類含量、孵放時間和溫度等因素進行具體研究。根據國家發布的《血液制品去除/滅活病毒技術方法及驗證指導原則》的要求，上述參數將嚴重影響其去除病毒的能力。

發明內容

本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種可降低病毒毒性并且安全、可靠的雙重病毒滅活制備破傷風人免疫球蛋白的方法。

為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：一種雙重病毒滅活制備破傷風人免疫球蛋白的方法，包括以下步驟：

1)將原料血漿消毒后稀釋0.3倍，調pH為7.15-7.25，降溫后噴入95％乙醇，乙醇的終濃度按照體積計為8％，噴入速度小于等于50L/h，再次調pH至7.15-7.25，并攪拌2小時后離心分離出組分一，離心后得到組分一上清液，離心轉速為8000-10000r/min；

2)將步驟1)得到的組分一上清液調pH為6.85-6.95，噴入95％乙醇，乙醇的終濃度按照體積計為20％，噴入速度小于等于50L/h，再次調pH為6.85-6.95，并攪拌2小時后靜置2小時，加入硅藻土，加入量為每1000L反應液加入20kg硅藻土，繼續攪拌20分鐘，壓濾分離出組分二和組分三的沉淀；

3)將步驟2)得到的組分二和組分三的沉淀以氯化鈉溶液溶解，調pH為5.05-5.15，調溫度為-0.5℃-0℃，加入95％乙醇至乙醇終濃度按照體積計為17％，而后攪拌2小時，靜置6-12小時，得到組分混合液，將組分混合液壓濾得到組分混合液上清；

4)將步驟3)得到的組分混合液上清脫鹽脫醇后超濾濃縮，得到組分混合濃縮液；

5)將步驟4)得到的組分混合濃縮液以凝膠柱進行層析提純，得到層析蛋白液；

6)將步驟5)得到的層析蛋白液進行透析后，再超濾濃縮，得到層析蛋白濃縮液；

7)將步驟6)得到的層析蛋白濃縮液中加入麥芽糖，調pH后補水至最終蛋白質量百分含量為5.05％-5.2％，除菌，得到免疫球蛋白一級制品；

8)將步驟7)得到的免疫球蛋白一級制品進行孵放滅活，得到免疫球蛋白二級制品；

9)將步驟8)得到的免疫球蛋白二級制品再次以水進行透析并超濾濃縮，得到免疫球蛋白二級制品濃縮液；

10)將步驟9)得到的免疫球蛋白二級制品濃縮液中按每升10-30g加入甘氨酸，并調pH得到免疫球蛋白三級制品；

11)將步驟10)得到的免疫球蛋白三級制品在無菌條件下進行DV50除病毒，得到破傷風人免疫球蛋白。

上述雙重病毒滅活制備破傷風人免疫球蛋白的方法，所述步驟1)中，原料血漿用0.14mol/L氯化鈉溶液稀釋，調pH所用溶液為pH為4的醋酸緩沖液，降溫至0℃，所用95％乙醇的溫度為-15℃。

上述雙重病毒滅活制備破傷風人免疫球蛋白的方法，所述步驟2)中，調pH所用溶液為pH為4的醋酸緩沖液，所用95％乙醇的溫度為-15℃。

上述雙重病毒滅活制備破傷風人免疫球蛋白的方法，所述步驟3)中，氯化鈉溶液的使用量為每kg組分二和組分三的沉淀以9L?0.01mol/L氯化鈉溶液溶解，調pH所用溶液為pH為4的醋酸鈉溶液。

上述雙重病毒滅活制備破傷風人免疫球蛋白的方法，所述步驟4)中，脫鹽脫醇超濾濃縮的具體方法為，用5倍體積的2-8℃的生理鹽水透析。

上述雙重病毒滅活制備破傷風人免疫球蛋白的方法，所述步驟5)中，所用凝膠柱為DEAE-SepHarose-FF凝膠柱。

上述雙重病毒滅活制備破傷風人免疫球蛋白的方法，所述步驟8)中，孵放病毒滅活條件為pH3.8-4.4，麥芽糖含量為90-110g/L，蛋白濃度為50-52g/L，孵放溫度為23-25℃，孵育時間為21天。