[發明專利]一種新的分枝桿菌菌種快速鑒定方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201210082662.9
• 申請日: 2012-03-26
• 公開（公告）號: CN102634575A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 吳雪瓊;張俊仙;富國良;孫偉民;陽幼榮;梁艷
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三O九醫院;無錫銳奇基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

技術領域

本發明涉及利用核酸擴增及其檢測體系，在臨床檢查中檢測和/或鑒定分枝桿菌菌種的方法和試劑盒，屬于醫學分子生物學診斷技術領域。

背景技術

結核病仍然是嚴重的公共衛生問題，尤其是在發展中國家。據WHO統計世界人口的1/3有結核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis，MTB)感染，是全世界感染性疾病中的第一大殺手。我國是全世界22個結核病高負擔國家之一，活動性肺結核病人數居世界第二位。目前我國全年齡組結核菌感染率為44.5％，全國約5.5億人受到結核菌感染。同時，非結核分枝桿菌(NTM)病也呈逐年上升趨勢，2000年，衛生部組織的調查數據顯示，NTM菌株分離率上升至11.1％，NTM病臨床表現與結核病相似，在無菌種鑒定結果的情況下，經常被誤診為結核病。大量研究及臨床治療病例表明非結核分枝桿菌對大多數一線抗結核藥物具有天然耐藥性，采用目前標準的化療方案治療無效。目前，非結核分枝桿菌病通常依據傳統的分枝桿菌菌種鑒定來確診，然而，傳統的分枝桿菌菌種鑒定繁瑣、費時，需1～2個月的時間，不能滿足臨床開展早期有效治療的需要，使非結核分枝桿菌病人通常被作為結核病人按常規治療，病人經長期常規治療而療效不佳，療程延長，成為難治、復治病人，細菌在局部播散。因此，分枝桿菌菌種的快速鑒定對結核病和非結核分枝桿菌病的早期診斷、鑒別診斷、有效治療和控制傳播都有重要意義。

傳統診斷臨床標本的分枝桿菌感染是基于鏡下抗酸染色，進而特殊培養及生化實驗鑒定菌種，最后檢測藥物敏感性。抗酸染色只能鑒別屬與屬外的特征，且只有在標本帶菌量在10⁴/ml以上時才能看見。由于多數分枝桿菌生長緩慢，鑒別到種的水平需要耗時4～8周，且影響因素多，重復性差。近年來，一直在開發于基因水平鑒定分枝桿菌菌種的技術，主要是利用聚合酶鏈反應(polymerase?chain?reaction，PCR)等核酸擴增技術的診斷技術。

目前利用PCR鑒定分枝桿菌菌種的方法主要是通過PCR擴增目標片段后，通過膜雜交或基因芯片檢測，但這些方法普遍存在一些問題，不適合在臨床上開展。(1)PCR菌種鑒定法。用各種分枝桿菌特異性引物對標本DNA進行一系列PCR擴增或多重PCR擴增，根據擴增產物所產生的特異性片段進行鑒定；或先用分枝桿菌屬特異的外部引物擴增，然后再用菌種特異的內部引物進行巢氏擴增鑒定。該法靈敏、快速，但目前能夠鑒定的菌種尚不多，主要有結核分枝桿菌、牛結核分枝桿菌、結核分枝桿菌復合群、鳥分枝桿菌、副結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌，而且鑒定未知的感染菌，需采用一系列種特異性引物進行擴增。(2)PCR-直接測序鑒定法。用分枝桿菌屬特異的引物對標本的16SrRNA或16S-23S?rRNA間隔區序列或65kD或32kD抗原基因進行PCR擴增，然后直接測定擴增產物的核苷酸序列，比較其核苷酸的差異來鑒定菌種。但該方法無法鑒別少數分枝桿菌，而且技術要求高，需昂貴的特殊儀器，而難以推廣。(3)PCR-DNA探針鑒定法：用分枝桿菌屬特異的引物對標本中分枝桿菌16S或16S-23S?rDNA進行擴增，然后與各種分枝桿菌特異的寡核苷酸探針進行反向斑點雜交或微孔板反向雜交鑒定菌種。該法較靈敏、快速，但目前只能鑒定部分菌種。(4)PCR-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)鑒定法。PCR-RFLP菌種鑒定法是以分枝桿菌屬特異性引物對標本中分枝桿菌65KD蛋白編碼基因、16S或16-23S?rDNA進行擴增，然后用不同的限制性內切酶消化擴增片段，通過電泳分析酶切圖譜來鑒定菌種。目前只能鑒定部分菌種，重復性還不夠理想。(5)PCR-基因芯片鑒定法?；蛐酒夹g是指將大量核酸分子以預先設計的方式固定在載體上，檢測帶標記的待測樣品DNA，是一種大規模分析遺傳差異的新方法。但這種方法操作復雜，易造成交叉污染，所需的點樣系統和熒光分析系統昂貴，而難以推廣應用。

近年來出現的實時熒光定量PCR(Real-time?quantitative?PCR)技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點成為了分子生物學研究中的重要工具。本發明利用熒光定量PCR技術平臺結合雙標記探針熔解曲線技術進行分枝桿菌菌種鑒定，實現了快速、簡單、靈敏、高效、廉價的分枝桿菌菌種鑒定的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速、簡單、靈敏、高效、廉價的分枝桿菌菌種鑒定的方法，以及利用所述方法同時鑒定多種分枝桿菌菌種的試劑盒。