[發明專利]一種新的分枝桿菌菌種快速鑒定方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201210082662.9
• 申請日: 2012-03-26
• 公開（公告）號: CN102634575A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 吳雪瓊;張俊仙;富國良;孫偉民;陽幼榮;梁艷
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三O九醫院;無錫銳奇基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

1.一種用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中包括兩對引物和三條探針，所述兩對引物包括引物TBleft1、TBleft2、TBright1和TBright2，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4所示，所述三條探針TBProbe1、TBProbe2、TBProbe3的5’端用報告熒光染料標記，3’端用淬滅熒光染料標記，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：13、SEQ?ID?NO：14、SEQ?ID?NO：15所示。

2.權利要求1所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其進一步還包括另外四對引物和三條探針，所述四對引物包括引物TBleft3、TBleft4、TBright3、TBright4、TBleft5、TBleft6、TBright5、TBright6，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9、SEQ?ID?NO：10、SEQ?ID?NO：11、SEQ?ID?NO：12所示，所述三條探針TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端用報告熒光染料標記，3’端用淬滅熒光染料標記，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：16、SEQ?ID?NO：17、SEQ?ID?NO：18所示。

3.權利要求1或2所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中所述的報告熒光染料選自FAM、ROX、HEX或JOE。

4.權利要求1或2所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中所述的淬滅熒光染料選自BHQ1、BHQ2、Eclipse或TAMRA。

5.權利要求1或2所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中探針TBProbe1、TBProbe2、TBProbe3的5’端分別用報告熒光染料FAM、HEX、ROX標記，3’端分別用淬滅熒光染料BHQ1或BHQ2標記。

6.權利要求1、2或5所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中探針TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端分別用報告熒光染料FAM、ROX、HEX標記，3’端分別用淬滅熒光染料BHQ1或BHQ2標記。

7.權利要求1至6中任一項所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中所述的分枝桿菌為臨床常見分枝桿菌，包括但不限于結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)、猿猴分枝桿菌(M.simiae)、胃分枝桿菌(M.gastri)、海分枝桿菌(M.marinum)、潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)、不產色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)、愛知分枝桿菌(M.aichiense)、鳥分枝桿菌(M.avium)、迪氏分枝桿菌(M.diernhoferi)、次要分枝桿菌(M.triviale)、偶然分枝桿菌(M.fortuitum)、土地分枝桿菌(M.terrae)、胞內分枝桿菌(M.intracellulare)、戈登分枝桿菌(M.gordonae)、蟾蜍分枝桿菌(M.xenopi)、龜分枝桿菌龜亞種(M.chelonae?subsp.chelonae)、龜分枝桿菌膿腫亞種(M.chelonae?subsp.abscessus)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、抗熱分枝桿菌(M.thermoresistibile)、田野分枝桿菌(M.agri)、母牛分枝桿菌(M.vaccae)、草分枝桿菌(M.phlei)。

8.權利要求1至7中任一項所述的用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，進一步還包括熱穩定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶及核酸序列擴增所需的其它各種試劑。

9.一種用于鑒定分枝桿菌菌種的方法，該方法包括：

(1)樣本處理及DNA提取；

(2)配制包括權利要求1或2所述試劑盒中引物對和探針的PCR反應體系；

(3)在熒光定量PCR儀上進行PCR擴增；

(4)PCR擴增結束后，進行熔解曲線(Melting?curve)分析。