[發(fā)明專利]一種能促進(jìn)VBNC細(xì)菌生長(zhǎng)并提高分離豐度的復(fù)蘇培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210081126.7
• 申請(qǐng)日: 2012-03-26
• 公開（公告）號(hào): CN102618464A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁林賢;陳建榮;金夷;林冬珍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物篩選和培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種活的非可培養(yǎng)（VBNC）菌種的復(fù)蘇培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

VBNC（viable?but?non-culture）指的是有些微生物可以在它們的棲息地被檢測(cè)到存在，但不能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行人工培養(yǎng)。1982年徐懷恕等通過對(duì)?V.cholerae和E.coli?存活規(guī)律的研究，首次發(fā)現(xiàn)并提出了細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（Viable?but?non-culturable?state，VBNC），即細(xì)菌處于不良環(huán)境條件下，其細(xì)胞通常縮成球形（最近許多研究中發(fā)現(xiàn)還有些細(xì)菌表現(xiàn)為體積增大，細(xì)胞伸長(zhǎng)），用常規(guī)方法培養(yǎng)不能使其生長(zhǎng)繁殖，但仍然具有代謝活性，在DNA合成抑制劑的作用下，添加一定量的營(yíng)養(yǎng)物培養(yǎng)時(shí)，這些細(xì)胞雖然不能分裂，但仍可以伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，證明其仍然存活，并非死亡.處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌，在一定的條件下可以復(fù)蘇。

現(xiàn)在在自然生態(tài)環(huán)境中的細(xì)菌能夠經(jīng)傳統(tǒng)分離法獲取的僅有0.01-10%，絕大部分處于活的非可培養(yǎng)（VBNC）、類似于休眠的狀態(tài)。就環(huán)境微生物資源而言，如何獲取自然界中90-99.99%的資源菌種需要有新思路、新方法的創(chuàng)新，才能挖掘、開發(fā)、利用這些未知的微生物資源。

中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)（申請(qǐng)?zhí)枺?00810051555.3?申請(qǐng)日：2008-12-09）公開了一種VBNC沙門氏菌的復(fù)蘇液及其制備方法和復(fù)蘇方法，復(fù)蘇液是由血清1份、滅菌純水1～3份組成，經(jīng)混合攪拌混勻，用微孔濾器過濾除菌制得；將進(jìn)入VBNC的沙門氏菌置于復(fù)蘇液中，在熱程控循環(huán)儀孔內(nèi)，采取遞增升溫方式，熱程控循環(huán)儀復(fù)蘇升溫與溫育時(shí)間程序選自在5℃到37℃區(qū)間，溫育時(shí)間為2MIN～1.5H；然后接種于SS液體培養(yǎng)基，并在氣浴振蕩搖床內(nèi)，200～220R/MIN培養(yǎng)。

（丁林賢,?蘇曉梅,?橫田明.?活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)菌的研究進(jìn)展及應(yīng)用展望.《微生物學(xué)報(bào)》.2011,?51（7）:?858-862.）?闡述了VBNC?狀態(tài)菌的形成機(jī)理、轉(zhuǎn)變與種類、復(fù)蘇、研究意義及其應(yīng)用展望。并報(bào)道了丁林賢等在十余年間針對(duì)生態(tài)環(huán)境中處于VBNC?狀態(tài)菌的復(fù)蘇、可培養(yǎng)化、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及潛在功能等方面的一些研究成果，擬為微生物資源的開發(fā)與應(yīng)用提供新的科學(xué)依據(jù)。并公開了復(fù)活促進(jìn)因子(?Rpf，resuscitation?promotingfactor)?是由藤黃球菌(M.?luteus)?分泌的一種能使處于VBNC?狀態(tài)的該菌重新恢復(fù)其生長(zhǎng)繁殖能力的蛋白質(zhì)，分子量約為16?－?17?kDa。Mukamolova報(bào)道了Rpf?可以復(fù)蘇處于VBNC?時(shí)期的革蘭氏陽(yáng)性菌Mycobacterium?屬的結(jié)核分枝桿菌(M．?tuberculosis)、

牛分枝桿菌(M．?bovis?)、堪薩斯分枝桿菌(M．kansasii)?，恥垢分枝桿菌(M．?smegmatis)?和鳥分枝桿菌(M．?avium)?等。并且同Rpf?相似的基因也在鏈霉菌、結(jié)核菌、棒狀桿菌等高GC?的革蘭氏陽(yáng)性菌中被發(fā)現(xiàn)。另外，Mukamolova等人還報(bào)道了Rpf?采用自分泌或旁分泌的方式分泌信號(hào)，不但能使休眠的微生物復(fù)活，還可以刺激正常菌的生長(zhǎng)，并能調(diào)控細(xì)胞的繁殖過程。但是在該文獻(xiàn)中沒有公開采用何種配方的復(fù)蘇培養(yǎng)基，而且在實(shí)際應(yīng)用中，單純的復(fù)活促進(jìn)因子在促進(jìn)非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)菌復(fù)蘇生長(zhǎng)以及分離豐度上效果還未非常顯著。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決活的非可培養(yǎng)（VBNC）菌種的復(fù)蘇生長(zhǎng)以及分離豐度的技術(shù)問題。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能促進(jìn)VBNC細(xì)菌生長(zhǎng)并提高分離豐度的復(fù)蘇培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基利用一種特殊蛋白質(zhì)信號(hào)分子構(gòu)建能夠促進(jìn)VBNC細(xì)菌復(fù)蘇生長(zhǎng)，提高從生態(tài)環(huán)境中分離VBNC細(xì)菌豐度。第二個(gè)目的是提供上述的復(fù)蘇培養(yǎng)基的制備方法。第三個(gè)目的是提供上述的復(fù)蘇培養(yǎng)基的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

一種能促進(jìn)VBNC細(xì)菌生長(zhǎng)并提高分離豐度的復(fù)蘇培養(yǎng)基，該復(fù)蘇培養(yǎng)基由培養(yǎng)基基液、細(xì)菌液和土壤液構(gòu)成；所述的細(xì)菌液由藤黃微球菌菌種在菌種液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后期，經(jīng)離心去除菌種液體培養(yǎng)基提取獲得蛋白質(zhì)，含有復(fù)活促進(jìn)因子Rpf，細(xì)菌液按體積比為培養(yǎng)基基液的0.5-30%；所述的土壤液由經(jīng)風(fēng)干、過篩、去除雜質(zhì)的土壤，加水，多次滅菌，過濾取濾液或離心取上清液，土壤液按體積比為培養(yǎng)基基液的0.1-20%。

作為優(yōu)選，上述的細(xì)菌液按體積比為培養(yǎng)基基液的1-10%，土壤液按體積比為培養(yǎng)基基液的1-5%。