[發明專利]含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體及其構建方法

無效

• 申請號: 201210080915.9
• 申請日: 2012-03-24
• 公開（公告）號: CN102618583A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 李力;劉芳;張瑋
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區腫瘤防治研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明涉及慢病毒表達載體，尤其是一種含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體及其構建方法。

背景技術

c-erbB2/HER2/neu編碼產物p185^erbB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，屬于表皮生長因子受體(EGFR)家族成員。c-erbB2/HER-2/neu基因的擴增和p185^erbB2蛋白的過度表達見于多種惡性腫瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、子宮內膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌。p185^erbB2過度表達提示腫瘤預后差，如轉移、復發、易耐藥及存活期短等。p185^erbB2作為腫瘤抗原，是一個理想的腫瘤治療靶點。美國食品及藥物管理局(FDA)已于1998年10月正式批準將一株抗p185^erbB2人源化抗體Trastuzumab(商品名Herceptin)用于臨床治療p185^erbB2高表達的轉移性乳腺癌。但是，國外進口抗體藥物價格昂貴，如何開發出擁有自主知識產權的抗p185^erbB2基因工程抗體對于國內患者具有十分重要的實際意義，其中，表達載體構建尤為關鍵。

目前構建載體表達抗體分子的主要方式有三類：一是將輕、重鏈基因分別連接至不同表達載體；二是輕、重鏈基因在同一載體上但處于不同的表達單元；三是以內部核糖體進入位點(IRES)連接輕、重鏈，使輕重鏈處于同一表達單元。但是，這些方式存在一些缺陷，如被表達的基因起始效率低，啟動子之間相互干擾，上游基因與下游基因的表達不平衡等，造成輕、重鏈表達水平存在顯著差異，導致完整抗體分子表達水平較低。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體及其構建方法，為今后抗p185^erbB2嵌合抗體的基礎研究及臨床應用奠定了基礎。

含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體，該載體是pWPI/H-F2A-L，其中H和L分別是抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體重鏈基因(SEQ.ID.No.2)和抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體輕鏈基因(SEQ.ID.No.1)，F2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽(SEQ.ID.No.15)。

抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體重鏈基因由鼠抗人p185^erbB2單抗重鏈可變區基因vH(SEQ.ID.No.13)和人IgG1的重鏈恒定區基因γ1(SEQ.ID.No.14)連接而成；抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體輕鏈基因由鼠抗人p185^erbB2單抗輕鏈可變區基因vL(SEQ.ID.No.16)和人IgG1的輕鏈恒定區基因κ(SEQ.ID.No.17)連接而成。

上述含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體的構建方法：用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/口蹄疫病毒2A多肽F/2A連接人鼠嵌合抗體的重鏈和輕鏈，形成一個開放閱讀框ORF，插入慢病毒表達載體pWPI，即得。

上述含F/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達載體的構建方法包括以下步驟：

<1>抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體重、輕鏈基因的擴增

用小量質粒抽提試劑盒抽提含有抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體輕、重鏈基因的質粒pWPI/H-IRES-L，并以此為模板，在DNA?Taq酶作用下分別用H-A和gamma1-B、L-A和Kappa-B擴增出嵌合重鏈基因H和嵌合輕鏈基因L；擴增條件為94℃預變性5min，94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，35個循環，最后72℃延伸10min；PCR產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收目的基因；

<2>全長嵌合抗體H-F2A-L的構建

①接頭片段F2A的合成??該片段由3部分構成：含NsiI酶切位點的嵌合重鏈H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含PvuII酶切位點的嵌合輕鏈L的5’端序列；