[發(fā)明專利]含F(xiàn)/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210080915.9
• 申請(qǐng)日: 2012-03-24
• 公開（公告）號(hào): CN102618583A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李力;劉芳;張瑋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 楊立華

1.一種含F(xiàn)/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體，其特征在于該載體是pWPI/H-F2A-L，其中H和L分別是抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體重鏈基因和抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體輕鏈基因，F(xiàn)2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含F(xiàn)/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體，其特征在于：所述抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體重鏈基因由鼠抗人p185^erbB2單抗重鏈可變區(qū)基因vH和人IgG1的重鏈恒定區(qū)基因γ1連接而成；所述抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體輕鏈基因由鼠抗人p185^erbB2單抗輕鏈可變區(qū)基因vL和人IgG1的輕鏈恒定區(qū)基因κ連接而成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述含F(xiàn)/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于：用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/口蹄疫病毒2A多肽F/2A連接人鼠嵌合抗體的重鏈和輕鏈，形成一個(gè)開放閱讀框ORF，插入慢病毒表達(dá)載體pWPI，即得。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述含F(xiàn)/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟：

<1>抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體重、輕鏈基因的擴(kuò)增

用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提含有抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體輕、重鏈基因的質(zhì)粒pWPI/H-IRES-L，并以此為模板，在DNA?Taq酶作用下分別用H-A和gamma1-B、L-A和Kappa-B擴(kuò)增出嵌合重鏈基因H和嵌合輕鏈基因L；擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；PGR產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收目的基因；

<2>全長(zhǎng)嵌合抗體H-F2A-L的構(gòu)建

①接頭片段F2A的合成??該片段由3部分構(gòu)成：含Nsi?I酶切位點(diǎn)的嵌合重鏈H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含Pvu?II酶切位點(diǎn)的嵌合輕鏈L的5’端序列；

②中間質(zhì)粒pUC57/F2A的構(gòu)建??將接頭片段F2A插入到pUC57質(zhì)粒的BamH?I和Xba?I之間，獲得中間質(zhì)粒pUC57/F2A；

③含有嵌合輕鏈的質(zhì)粒pUC57/F2A-L的構(gòu)建??用BamH?I和Xba?I雙酶切質(zhì)粒pUC57/F2A，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒分別回收接頭片段F2A和載體片段pUC57；進(jìn)而用Pvu?II酶切接頭片段F2A，獲得5’端為BamH?I酶切位點(diǎn)和3’端為Pvu?II酶切位點(diǎn)的接頭片段F2A；用Pvu?II和Xba?I雙酶切嵌合輕鏈L，獲得5’端為Pvu?II酶切位點(diǎn)和3’端為Xba?I位點(diǎn)的輕鏈片段L；然后，將這兩個(gè)片段用T4DNA連接酶連接后克隆入載體pUC57，獲得含有嵌合輕鏈的質(zhì)粒pUC57/F2A-L；

④片段H-F2A-L的拼接??用BamH?I酶和Xba?I酶切pUC57/F2A-L，獲得片段F2A-L；進(jìn)而用Nsi?I酶切片段F2A-L，獲得5’端為Nsi?I酶切位點(diǎn)和3’端為Xba?I酶切位點(diǎn)的片段F2A-L；用BamH?I和Nsi?I雙酶切嵌合重鏈H，獲得5’端為BamH?I酶切位點(diǎn)和3’端為Nsi?I位點(diǎn)的重鏈片段H；通過T4DNA連接酶與片段F2A-L相連，獲得5’端為BamH?I酶切位點(diǎn)和3’端為Xba?I位點(diǎn)的嵌合抗體全長(zhǎng)片段H-F2A-L；

<3>慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pwpI/H-F2A-L的構(gòu)建

將純化回收的片段H-F2A-L，用DNA末端補(bǔ)平試劑盒補(bǔ)平兩端；同時(shí)用PmeI酶切慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPI，經(jīng)SAP去磷酸化后，用T4DNA連接酶與H-F2A-L連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)細(xì)菌，抽提質(zhì)粒后用載體測(cè)序引物EF1α和重鏈下游引物gamma1-B作PCR，篩選正向插入陽(yáng)性克隆pWPI/H-F2A-L，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，即得；

所述各引物為

H-A：5’-CGC?GGA?TCC?GCC?ACC?ATG?GGA?TGG?AGC?TGT?ATC?ATC?CTC?T-3’，

gamma1-B：5’-ATC?GAT?CGT?CAT?TTA?CCC?GGA?GAC?AGG?GAG?AG-3’；

L-A：5’-TGC?ATG?CAT?GCC?ACC?ATG?GGA?TGG?AGC?TGT?ATC?ATC?CTC?T-3’，

Kappa-B：5’-GGG?TCT?AGT?CTA?ACA?CTC?TCC?CCT?GTT?GAA?GCT-3’；

EF1α：5’-TCA?AGC?CTC?AGA?CAG?TGG?TTC-3’。