[發明專利]一種利用家蠶生物反應器生產豬瘟病毒亞單位疫苗的方法

無效

• 申請號: 201210080028.1
• 申請日: 2012-03-23
• 公開（公告）號: CN103319573A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 張許科;孫進忠;白朝勇
• 申請（專利權）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號: C07K14/18
• 分類號: C07K14/18;C12N15/866;A01K67/04;A61K39/187;A61P31/14;G01N33/68
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及利用基因工程手段在家蠶體內大量表達豬瘟病毒重組E2蛋白及利用該重組蛋白制備豬瘟重組亞單位疫苗的方法及產品。

背景技術

豬瘟(Classical?Swine?Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical?Swine?Fever?Virus，CSFV)引起的，呈急性或慢性經過，病死率高，其病理特征是小血管壁變性，內臟器官多發性出血、梗塞、壞死，是一種危害性極大的豬傳染病。

中國專利CN101736017A公開了一種使用重組家蠶桿狀病毒(BmNPV)生產豬瘟病毒E2蛋白的方法，使用BmNPV感染家蠶幼蟲或蠶蛹表達外源蛋白(CSFV?E2蛋白)，即通過構建重組BmNPV，然后感染家蠶幼蟲或蠶蛹，以表達E2蛋白。但是上述使用BmNPV表達系統感染家蠶的方法，重組BmNPV病毒的構建步驟繁瑣；而且BmNPV重組病毒還需要在家蠶細胞上通過多輪空斑篩選進行重組病毒篩選，工藝和步驟較為繁復，且家蠶細胞培養周期長，培養困難，技術要求較高，并有很高比例的假陽性的出現。此外，使用重組BmNPV感染家蠶有時會引起家蠶的劇烈的癥狀，導致蠶體或蠶蛹過早死亡而引起蠶體腐敗等問題，產生的重組蛋白的產量和質量不穩定。

發明內容

有鑒于此，本發明的主要目的在于提供一種利用家蠶幼蟲和/或蠶蛹等家蠶生物反應器來表達豬瘟病毒重組E2蛋白的方法，是通過基因工程技術將豬瘟病毒E2基因及其上游90個核苷酸序列重組入苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)的基因組上，獲得重組的AcNPV，通過將上述重組病毒注射家蠶或蛹來表達豬瘟病毒重組E2蛋白。

本發明的另一主要目的在于通過上述重組豬瘟病毒重組E2蛋白生產豬瘟亞單位疫苗的方法及其產品，包括豬瘟亞單位E2蛋白抗原、免疫佐劑。

技術方案

為了實現上述目的，本發明采用以下技術手段：

一種豬瘟病毒E2蛋白，所述豬瘟病毒重組E2蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?NO1.所示序列，其中包括豬瘟病毒重組E2蛋白的氨基酸序列與豬瘟病毒重組E2蛋白的氨基酸序列上游30個氨基酸。

本發明所述的豬瘟病毒重組E2蛋白的氨基酸序列可以在一定范圍內進行修飾、改變，所獲得的修飾后的蛋白質或蛋白質的片段與豬瘟病毒重組E2蛋白有相同的生物學功能與抗原活性。對蛋白質進行修飾和改變的方法為本領域常規的方法，為本領域普通技術人員所熟悉。按照現代基因工程技術理論，氨基酸序列同源性70％以上的蛋白質在生物學中被認為是具有相同生物學功能的蛋白質。在此范圍內對蛋白質氨基酸序列進行的修飾和突變，如點突變、插入或缺失或插入功能性片段等，均被認為并未改變蛋白質本身的生物學特性，也不會改變蛋白質的免疫原性。因此，通過本領域常用的方法獲得的與本發明所述的重組蛋白有至少70％同源性的蛋白質或免疫性片段都具有與本發明所述豬瘟病毒重組E2蛋白相同的生物學特性或免疫活性，都在本發明的保護范圍之內。

優選地，本發明所述的豬瘟病毒重組E2蛋白為具有與SEQ?ID?NO1.序列至少70％同源性的序列；更優選地，為具有與SEQ?ID?NO1.序列至少80％同源性的序列；更優選地，為具有與SEQ?ID?NO1.序列至少90％同源性的序列；最優選地，豬瘟病毒重組E2蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?NO1.所示序列。

本發明還提供一種豬瘟病毒重組E2蛋白，所述豬瘟病毒重組E2蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?NO2.所示序列，本發明還提供具有與SEQ?ID?NO2.序列至少70％同源性的序列。更優選地，為具有與SEQ?ID?NO2.序列至少80％同源性的序列；更優選地，為具有與SEQ?ID?NO2.序列至少90％同源性的序列；最優選地，豬瘟病毒重組E2蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?NO2.所示序列，所述SEQ?ID?NO2.序列即為豬瘟病毒C株的E2蛋白。

本發明還提供了利用家蠶生物反應器生產豬瘟病毒重組E2蛋白的方法，包括以下步驟：

1)克隆豬瘟病毒E2蛋白的編碼基因序列，至昆蟲核型多角體病毒(AcNPV)的表達轉移載體pFastBacI上，獲得重組表達轉移載體；

2)將重組表達轉移載體轉化入含有桿狀病毒載體的大腸桿菌感受態細胞DH10Bac中，獲得含有豬瘟病毒E2基因的重組桿狀病毒基因組穿梭載體；

3)將上述重組桿狀病毒基因組穿梭載體轉染入昆蟲細胞中，獲得帶該豬瘟病毒E2基因的重組昆蟲核型多角體病毒；