[發明專利]一種用于全基因組或跨基因組沉默的長雙鏈RNA表達載體

有效

• 申請號: 201210080027.7
• 申請日: 2012-03-23
• 公開（公告）號: CN103320462A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 劉培;李天驕;唐秀文
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及RNA干涉技術和功能基因組學，具體地說，涉及一種用于全基因組或跨基因組沉默的長雙鏈RNA表達載體。

背景技術

自從在秀麗線蟲(Caenorhabditis?elegans)中發現基于RNA干涉(RNAi)的基因敲除(knock?out)或敲減(knock?down)以來，RNA干涉技術已廣泛應用于生命科學的各個領域，對揭示新的生命現象和發明新的技術方法都具有革命性意義。RNAi已用于微生物、線蟲、果蠅、哺乳動物和植物特定基因功能的分析。在高通量基因克隆和功能驗證方面，RNAi最早應用體外合成的dsRNA來大規模敲出或敲減C.elegans基因以便從基因組水平來剖析基因的功能。雖然在果蠅和哺乳動物培養細胞中有時存在脫靶(off?target)現象，但是RNAi技術在這些生物中也取得了巨大的成功。在植物中，利用內含子兩端的特定基因反向重復序列產生發卡雙鏈小RNA(short?hairpin?RNA，shRNA)可以通過誘導植物內源基因高效沉默來研究特定基因的功能。一些基于發卡小干涉RNA(hairpin?small?interfering?RNA，hsiRNA)的高效載體如pHANNIBAL/KANNIBAL，pHellsgate等已用于敲減一個或幾個特定基因的表達。但是，由于克隆過程的復雜，這些載體在全基因組RNAi的功能基因組學研究中的應用受到限制。為了獲得可用于基因組水平RNAi的載體，Brummell等(2003)構建了只需一步克隆操作的SHUTR載體，通過在一個基因的末端連接一個3’-UTR(NOS終止子)的反向重復序列，在植物中產生雙鏈發卡結構RNA來沉默靶基因。這個載體在番茄和擬南芥中的有效性分別用PG基因、T10P11.13和Athb-1基因進行了驗證，沉默效率約為90％，并且用于表達葉肉細胞cDNA文庫，獲得相關突變體。與傳統T-DNA和轉座子插入不同，RNAi技術有很多優勢：1.RNAi引起的功能缺失(loss-of-function)突變體篩選是基于序列的同源性，因而較隨機插入方法需要小得多的突變群體而且目的基因鑒定很容易。2.RNAi基因表達敲減產生的突變是顯性的，在第一代轉基因群體便可以進行表型篩選，節省大量突變體篩選所用時間和勞力。3.RNAi可以敲減多個相近基因的表達進而克服基因的冗余性。4.由于RNAi是一種可以時空特異調控的基因表達敲減體系，因此可以克服必需基因敲除引起的致死性。由此可見，RNAi在植物功能基因組，特別是具有復雜基因組的作物功能基因組研究中，突變篩選和基因克隆最具潛力的工具。高通量RNAi技術在玉米中已得到初步驗證，在766個獨立轉基因系中沉默了99個基因，RNAi轉基因結構可以在玉米中穩定遺傳，并且可以沉默目的基因及其相近基因，證明了RNAi技術在作物功能基因組中的可行性。無論發卡結構的雙鏈小RNA(shRNA)，還是較長的雙鏈RNA(dsRNA＞200bp)都可以高效沉默植物內源基因的表達。體外合成的或細菌中用共軛啟動子產生的dsRNA已成功應用于C.elegans和果蠅的功能基因組研究來鑒定基因功能。雖然基于長雙鏈RNA(ldsRNA)的反義抑制技術已廣泛應用于植物基因功能研究，但是ldsRNA基因沉默在植物功能基因組研究中還沒有報道。與C.elegans類似，外源ldsRNA浸泡和飼喂也可以沉默寄生線蟲體內同源基因的表達。寄主輸出性的RNA干涉技術(Host-Delivered?RNAi，HD?RNAi)利用寄主植物表達害蟲的長雙鏈RNA(ldsRNA)，通過進食進入害蟲體內引起害蟲重要功能基因的沉默，達到殺死或減弱害蟲生活力的目的。HD?RNAi正成為獲得害蟲抗性植物極具潛力的新技術，已成功用于獲得對昆蟲和線蟲具有抗性的植物。然而，HD?RNAi技術的效果隨著靶基因的不同而變化。在寄主中高通量的表達害蟲基因的長片段雙鏈RNA(ldsRNA)并結合抗蟲篩選，是獲得大量理想抗蟲基因的有效途徑。但是，具有這些功能的高通量RNA干涉載體仍不成熟。

發明內容

本發明的目的是利用共軛啟動子和LoxP及attP位點序列，提供一種高通量產生ldsRNA的載體。

為了實現本發明目的，本發明的一種用于全基因組或跨基因組沉默的長雙鏈RNA表達載體，其為整合有以下序列的植物雙元表達載體：終止子-啟動子-LoxP位點序列-attP1位點序列-ccdB基因-CmR基因-attP2位點序列-LoxP位點序列-啟動子-終止子，是一種可高通量產生植物或病蟲基因長雙鏈RNA的高效植物表達載體。