[發(fā)明專利]一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210076251.9
• 申請日: 2012-03-21
• 公開（公告）號: CN102618500A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王楠;張同存;俞如發(fā)
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于干細胞誘導(dǎo)分化研究領(lǐng)域，涉及一種誘導(dǎo)干細胞分化的方法，尤其是一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法。

背景技術(shù)

糖尿病是一組以血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病，主要是由于胰島素分泌相對或絕對不足或胰島素受體作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂性疾病。糖尿病死亡率僅次于心腦血管和腫瘤，嚴重威脅人類生命和健康。隨著其發(fā)病率的逐年上升，糖尿病對人類健康的危害還將進一步加重。世界衛(wèi)生組織估計，全世界有1.8億人患有糖尿病，這一數(shù)字很可能到2030年將翻番一倍以上。在糖尿病治療方面，傳統(tǒng)的治療無外乎促進β細胞胰島素的分泌、增加外周組織對胰島素的敏感性及使用外源胰島素幾個方面，然而這些治療策略顯然未能使糖尿病患者得到根治；胰腺移植和胰島移植又難以克服供體不足和免疫排斥這兩大問題，使其臨床應(yīng)用和效果也受到極大影響。因此迫切需求治愈糖尿病的新方法。干細胞以其極強自我更新和多向分化潛能，已成為人們尋找替代患者自身免疫系統(tǒng)破壞的胰島細胞的最佳種子細胞來源，以干細胞移植為主的再生治療為糖尿病的根治帶來了新的希望。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal?stem?cells，MSCs)，是目前最有應(yīng)用優(yōu)勢的種子細胞。間充質(zhì)干細胞具有非常強的自我增殖能力和分化的多潛能性，國內(nèi)外的研究表明能根據(jù)特定的環(huán)境分化為胰島素分泌細胞，并且間充質(zhì)干細胞具有其它干細胞所不可比擬的優(yōu)點，如取材方便、增殖和分化能力強、移植無免疫原性，同時也避免了胚胎干細胞移植所面臨的倫理問題。

目前對于間充質(zhì)干細胞向胰島細胞分化的誘導(dǎo)方案可以歸為以下兩類：多數(shù)為集中神經(jīng)生長因子及活化素的聯(lián)合應(yīng)用，如bFGF、EGF等；另一種方法是轉(zhuǎn)染胰島細胞發(fā)育、胰島素分泌過程中的關(guān)鍵基因，如PDX-1、Ngn3等轉(zhuǎn)錄因子。但是現(xiàn)有研究誘導(dǎo)分化方案有很大局限性，分化效率不高，應(yīng)用時效果不理想。

血清反應(yīng)因子(SRF)是一種高度保守且廣泛存在于多種生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它可以與多個基因啟動子上CArG?box位點特異性結(jié)合，進而特異性上調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達水平。目前發(fā)現(xiàn)其主要功能是參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)骨架肌動蛋白和其他一些支架蛋白的基因轉(zhuǎn)錄過程，進而參與多種哺乳動物生理過程，例如肌原纖維發(fā)育及其分化為骨骼肌、平滑肌等過程。最新的研究發(fā)現(xiàn)胰島素基因啟動子上含有SRF的結(jié)合位點CArG?box，并且SRF和PDX-1可以協(xié)同促進胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，但是利用SRF與生長因子組合共同誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向平滑肌細胞分化尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，本方法利用SRF基因修飾與多種生長因子協(xié)同誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向胰島素分泌細胞分化。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達質(zhì)粒；

(2)誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細胞向Nestin⁺細胞分化：當步驟(1)中細胞至70-80％融合時，去除原有培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ培養(yǎng)5～6小時；

所述步驟(2)中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ為含有5mmol/L?β-巰基乙醇和2％胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖；

(3)誘導(dǎo)Nestin⁺細胞向胰腺始祖細胞分化：在步驟(2)獲得細胞中，去除步驟(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ培養(yǎng)7～8天；

步驟(3)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ為含有5～20nmol/L?bFGF、5～20nmol/L?EGF、2％B27、0.1％β-巰基乙醇和2％胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖；

(4)誘導(dǎo)胰腺始祖細胞向胰島素分泌細胞分化：在步驟(3)獲得細胞中，去除步驟(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅲ，同時轉(zhuǎn)染步驟(1)中的SRF基因的重組真核表達質(zhì)粒，培養(yǎng)7～8天；

步驟(4)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅲ為含有5～20nmol/L?Exendin-4、5～20mmol/L尼克酰胺、2％B27和2％胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。

而且，步驟(1)中構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達質(zhì)粒，真核表達載體為pEGFP、pcDNA3.1或pCMV。

而且，步驟(2)中所述的人間充質(zhì)干細胞包括羊水、骨髓、胎盤、臍帶血或脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞。