[發(fā)明專利]一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210076251.9
• 申請日: 2012-03-21
• 公開（公告）號: CN102618500A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王楠;張同存;俞如發(fā)
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

1.一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒；

(2)誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向Nestin⁺細(xì)胞分化：當(dāng)步驟(1)中細(xì)胞至70-80％融合時，去除原有培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ培養(yǎng)5～6小時；

所述步驟(2)中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ為含有5mmol/L?β-巰基乙醇和2％胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖；

(3)誘導(dǎo)Nestin⁺細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化：在步驟(2)獲得細(xì)胞中，去除步驟(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ培養(yǎng)7～8天；

步驟(3)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ為含有5～20nmol/L?bFGF、5～20nmol/L?EGF、2％B27、0.1％β-巰基乙醇和2％胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖；

(4)誘導(dǎo)胰腺始祖細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化：在步驟(3)獲得細(xì)胞中，去除步驟(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅲ，同時轉(zhuǎn)染步驟(1)中的SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，培養(yǎng)7～8天；

步驟(4)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅲ為含有5～20nmol/L?Exendin-4、5～20mmol/L尼克酰胺、2％B27和2％胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟(1)中構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，真核表達(dá)載體為pEGFP、pcDNA3.1或pCMV。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于：步驟(2)中所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞包括羊水、骨髓、胎盤、臍帶血或脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于：步驟(4)中所述的SRF真核表達(dá)質(zhì)粒為去內(nèi)毒素的質(zhì)粒，質(zhì)粒超螺旋帶型清晰，A260/A280＝1.8～2.0。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟(3)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ為含有10nmol/L?bFGF、10nmol/L?EGF、2％B27、0.1％β-巰基乙醇和2％胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟(4)中所述的誘導(dǎo)液培養(yǎng)基Ⅲ為含有10nmol/L?Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2％B27和2％胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。