[發明專利]克隆虉草Actin基因的PCR引物及方法

無效

• 申請號: 201210075718.8
• 申請日: 2012-03-21
• 公開（公告）號: CN102586245A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 張蘊薇;叢麗麗;楊富裕;張新全;于曉丹;劉斯佳;李洪超
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12N15/29;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體地，涉及用于克隆虉草Actin基因的PCR引物及克隆虉草Actin基因的方法。

背景技術

虉草(Phalaris?arundinacea)，別名草蘆、園草蘆，為禾本科虉草屬(Phalaris)植物。因其具有較強的抗逆性和較高的產量及營養價值而被廣泛用于飼草、人工濕地植物、造紙原料和生物質能源等。虉草是禾本科多年生大型直立C₃植物，根系強大具根狀莖，根系深度達3m以上。與其他禾本科牧草比較，虉草具有生物產量高、維護成本低、抗逆性強、木質纖維含量高、易于管理和收獲等特點，是可再生的能源，在北方氣候條件下可以栽培后連續收割10～12年，具有開發成生物質能源的潛力。在芬蘭，約1％的農作物區種植虉草。芬蘭的農業部和林業部官方制訂到2015年虉草栽培面積是現在5倍的目標，超過了現在油菜，馬鈴薯、甜菜、白菜型油菜的總面積。虉草育成品種相對較少，第一個虉草注冊品種是在1946年由美國公布的“Ioreed”。目前已培育出十幾個栽培品種，我國目前通過國家牧草品種審定委員會審定的虉草新品種只有3個：“通選7號”草蘆、“川草3號”虉草和威寧草蘆。為了加快育種進程，育種工作者在傳統的育種基礎上，通過分子育種手段，可以縮短育種周期和加快育種的速度。

實時定量PCR方法在植物的分子育種領域具有重要的作用。該方法是檢測低豐度mRNA的敏感方法，通過比較不同樣本的RNA產量、質量及逆轉錄效率上可能存在的差別，獲得目標基因特異性表達的真正差異。通過定量的方法，可以進行目標基因檢測或診斷，基因劑量或拷貝數檢測和基因突變分析及多態性研究。但是，在應用實時熒光定量PCR檢測基因的表達量中，必須選擇合適的內參基因進行校正和標準化。內參基因在PCR擴增中的變化可以反映RNA數量、質量和cDNA合成效率的變化。實時定量反轉錄PCR技術能夠快速、精確的檢測樣品mRNA擴增效率和鑒定基因轉錄數量。在這種分析中最重要的問題是mRNA分離和反轉錄效率的變化引起的樣品間遺傳物質數量變異。因此，需要內參基因對樣品變異進行標準化。內參基因是在假設表達恒定的基礎上，應用實時定量PCR檢測目標基因mRNA表達水平的標準化。有內參基因作標定，便能對基因進行定量。

肌動蛋白(Actin)是真核生物中普遍存在的一種重要的蛋白質，是構成細胞骨架和肌肉肌小節的主要成分，執行著重要的生理功能，如細胞分裂、細胞運動、細胞形狀變化、內吞作用、胞吐作用以及多種細胞運動，如頂端生長、細胞器運動、胞質環流、花粉管生長等。高等動植物中，肌動蛋白都是由多基因編碼。不同生物肌動蛋白具有高度保守性，這些基因高度相似，通過多輪復制由一個基因祖先進化而來。Actin基因在各種組織中恒定表達，是一種廣泛參與真核細胞生理過程的管家基因，因而常被作為研究其它基因的表達模式及調控機制的分子內標。迄今為止，已在許多高等植物，如水稻、玉米、小麥、大麥、谷子、玉蘭、花生、堿蓬、胡蘿卜、大豆、霸王、擬南芥、煙草和向日葵等中克隆到了Actin基因。然而，有關虉草Actin基因的研究尚未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供用于擴增虉草Actin基因的特異性引物；本發明目的還在于提供利用特異性引物克隆虉草Actin基因的方法。

根據已經在GenBank上登錄的虉草近源植物Actin基因的cDNA序列，其中主要包括水稻、玉米、星星草、黑麥草和羊草等序列。用DNAMAN軟件分析這些cDNA序列的保守區，用Premier?Primer?5.0檢查引物的特異性及其他各項指標，設計引物，并由上海生工合成引物。在所設計的引物中篩選特異性好的引物對繼續做回收轉化和鏈接試驗。

本發明提供的擴增虉草Actin基因的特異性引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1，SEQ?ID?NO.2所示。

本發明提供了克隆虉草Actin基因的方法，包括以下步驟：

1)提取虉草總RNA，反轉錄成cDNA；

2)以步驟1)獲得的cDNA為模板，以SEQ?ID?No.1，SEQ?ID?NO.2所示的特異性引物對為引物進行PCR反應；

3)回收和純化PCR產物；

4)PCR產物與T載體連接，轉化感受態細胞；

5)進行藍白斑篩選和菌落PCR，鑒定陽性菌落；

6)將陽性菌落擴大培養。