[發(fā)明專利]克隆虉草Actin基因的PCR引物及方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210075718.8
• 申請日: 2012-03-21
• 公開（公告）號: CN102586245A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?zhí)N薇;叢麗麗;楊富裕;張新全;于曉丹;劉斯佳;李洪超
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12N15/29;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

1.擴(kuò)增虉草Actin基因的特異性引物，其核苷酸序列如SEQ?IDNo.1，SEQ?ID?NO.2所示。

2.克隆虉草Actin基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取虉草總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

2)以步驟1)獲得的cDNA為模板，以權(quán)利要求1所述的特異性引物對為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；

3)回收和純化PCR產(chǎn)物；

4)PCR產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；

5)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和菌落PCR，鑒定陽性菌落；

6)將陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，還包括將擴(kuò)大培養(yǎng)的陽性菌落進(jìn)行序列測定。

4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的虉草總RNA提取自虉草葉片組織。

5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的PCR反應(yīng)，其25μl的反應(yīng)體系為：10μM正向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，PCR?Mix12.5μl，ddH₂O10.5μl，cDNA1μl。

6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，1個循環(huán)；94℃變性30s，50-57℃退火30s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃5min。

7.如權(quán)利要求2所述的方法，PCR反應(yīng)的退火溫度為54.5℃。

8.權(quán)利要求2-7任一所述的方法獲得的虉草Actin基因。

9.權(quán)利要求2-7任一所述的方法獲得的虉草Actin基因作為內(nèi)參基因的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求2-7任一所述的方法獲得的虉草Actin基因在分子遺傳育種領(lǐng)域中的應(yīng)用。