[發明專利]一種鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉錄-復合套式聚合酶鏈式反應診斷試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201210073155.9
• 申請日: 2012-03-19
• 公開（公告）號: CN102605105A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 朱小甫;吳旭錦;徐德乾
• 申請（專利權）人: 咸陽職業技術學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
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技術領域

本發明涉及的鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉錄-復合套式聚合酶鏈式反應診斷試劑盒及檢測方法，屬于動物醫學動物疫病分子生物學診斷技術領域。?

背景技術

豬瘟(Classical?swine?fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical?swine?fever?virus，CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，迄今仍是我國最重要的豬傳染病之一，每年引起豬只發病死亡的損失巨大，因此世界動物衛生組織(World?organization?for?animal?health，OIE)將其列為16種A類法定傳染病之一，我國農業部將其列為一類傳染病。豬瘟是養豬業的一種毀滅性傳染病，幾乎遍及全世界(除北美洲和大洋洲外)，死亡率高達80％～90％。?

1954年，我國學者周泰沖等通過將CSFV強毒Shimen株連續在兔體傳代數百代后致弱，成功研制出了世界公認有良好免疫效果的豬瘟兔化弱毒疫苗，至今已應用了半個世紀，對我國豬瘟疫情的控制做出了積極貢獻。但是，弱毒疫苗的使用對豬瘟的診斷造成了很大干擾。鑒于以上弊端，西方發達國家對豬瘟采取不免疫，感染豬撲殺的策略進行凈化。但我國目前對撲殺的損失還難以承受，主要依賴于疫苗接種進行豬瘟的控制。?

我國使用的診斷豬瘟的血清學方法有瓊脂擴散試驗、熒光抗體試驗、間接血凝試驗、中和試驗、酶聯免疫吸附試驗和免疫膠體金技術，分子生物學?方法有RT-PCR技術和核酸探針技術?，F有的血清學檢測方法大多數是檢測抗體水平，在疫苗免疫效果的評價上有重要作用，但在豬瘟的定性診斷上尚需要依賴病原的檢測。在病原檢測上常用熒光抗體試驗和RT-PCR技術。由于我國多年一直采用疫苗預防為主的豬瘟防控策略，豬群疫苗免疫覆蓋率高，導致疫苗毒株在豬群中廣泛存在。常規熒光抗體試驗和RT-PCR技術不能區分疫苗毒株和豬瘟流行毒株，在診斷結果的判定上存在困難。?

目前，在國內有學者嘗試建立相關的鑒別診斷方法，如趙耕等建立了RT-PCR和酶切的方法區分豬瘟強毒與疫苗弱毒，但該技術無法確診早期感染；趙建軍等建立了鑒別豬瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的復合熒光定量RT-PCR檢測方法，但成本較高，目前只應用于實驗室檢測。李艷等建立了鑒別豬瘟強毒和弱毒的RT-nPCR檢測方法，強毒出現1條343bp的特異條帶，弱毒出現1條447bp的特異條帶，但是由于2條片段大小相近，在一次反應中不易做出準確判斷。李安等建立的鑒別方法擴增的極限為6.5×10^-2pg·L^-1，靈敏度較低，由于豬瘟病毒在組織病料中的拷貝數較低，靈敏度不夠可能會造成用組織病料診斷時的漏診。?

發明內容

針對上述現有技術中存在的問題與缺陷，本發明的是目的在于提供一種用于鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉錄-復合套式聚合酶鏈式反應診斷試劑盒，該試劑盒操作簡便、結果直觀、靈敏度高、特異性好的區分豬瘟流行毒株與疫苗毒株的診斷試劑盒。?

實現上述發明目的的技術方案是一種用于鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉錄-復合套式聚合酶鏈式反應診斷試劑盒，該試劑盒由反轉錄混合液、一?擴混合液、二擴混合液、陰性對照和陽性對照組成；?

所述反轉錄混合液由DEPC處理滅菌水、2.5m?mol·L^-1dNTP、5×AMVBuffer、25μmol·L^-1S2下游引物、5U/μL?AMV反轉錄酶和40U/μL?HPR?I?RNA酶抑制劑組成；每個反應體積比為10∶4∶4∶1∶0.5∶0.5，共計20μL，50個反應共計1000μL，裝成1管；?

所述一擴混合液由滅菌三蒸水、10×PCR?Buffer、2.5m?mol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1S1上游引物、25μmol·L^-1S2下游引物、5U/μL?rTaq?DNA聚合酶組成，每個反應體積比為17∶2.5∶2∶0.5∶0.5∶0.5，共計23μL，50個反應共計1150μL，裝成1管；?

所述二擴混合液由滅菌三蒸水、10×PCR?Buffer、2.5m?mol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1S3上游引物、25μmol·L^-1S4下游引物、25μmol·L^-1S5下游引物、5U/μLrTaq?DNA聚合酶組成，每個反應體積比為16.5∶2.5∶2∶0.5∶0.5∶0.5，共計23μL，50個反應共計1150μL，裝成1管；?