[發(fā)明專利]一種鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷試劑盒及檢測方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210073155.9
• 申請(qǐng)日: 2012-03-19
• 公開（公告）號(hào): CN102605105A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱小甫;吳旭錦;徐德乾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，其特征在于，該試劑盒由反轉(zhuǎn)錄混合液、一擴(kuò)混合液、二擴(kuò)混合液、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照組成；

所述反轉(zhuǎn)錄混合液由DEPC處理滅菌水、2.5m?mol·L^-1dNTP、5×AMVBuffer、25μmol·L^-1S2下游引物、5U/μL?AMV反轉(zhuǎn)錄酶和40U/μL?HPR?I?RNA酶抑制劑組成；每個(gè)反應(yīng)體積比為10∶4∶4∶1∶0.5∶0.5，共計(jì)20μL，50個(gè)反應(yīng)共計(jì)1000μL，裝成1管；

所述一擴(kuò)混合液由滅菌三蒸水、10×PCR?Buffer、2.5m?mol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1S1上游引物、25μmol·L^-1S2下游引物、5U/μL?rTaq?DNA聚合酶組成，每個(gè)反應(yīng)體積比為17∶2.5∶2∶0.5∶0.5∶0.5，共計(jì)23μL，50個(gè)反應(yīng)共計(jì)1150μL，裝成1管；

所述二擴(kuò)混合液由滅菌三蒸水、10×PCR?Buffer、2.5m?mol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1S3上游引物、25μmol·L^-1S4下游引物、25μmol·L^-1S5下游引物、5U/μLrTaq?DNA聚合酶組成，每個(gè)反應(yīng)體積比為16.5∶2.5∶2∶0.5∶0.5∶0.5，共計(jì)23μL，50個(gè)反應(yīng)共計(jì)1150μL，裝成1管；

所述陰性對(duì)照為正常細(xì)胞培養(yǎng)上清液，陽性對(duì)照為HCLV株細(xì)胞培養(yǎng)液；

所述的引物S1序列為：5’-GACACTAGYGCAGGCAAYA-3’

所述的引物S2序列為：5’-AGTGGGTTCCAGGARTAC-3’

所述的引物S3序列為：5’-CCACGGGGGTGCCCTACAA-3’

所述的引物S4序列為：5’-CCTGGCATGTAACTA-3’

所述的引物S5序列為：5’-CTCTCGGTGAGAAATTTG-3’。

2.權(quán)利要求1所述用于鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：

1)TRIzol?Reagent試劑法提取待檢樣品總RNA，空氣中自然干燥；

2)取反轉(zhuǎn)錄混合液20μL，充分吹吸溶解總RNA，42℃水浴反轉(zhuǎn)錄90min，取出置-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

3)取一擴(kuò)混合液23μL，加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，混合均勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，94℃45s，54℃50s，72℃50s共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；

4)取二擴(kuò)混合液23μL，加入一擴(kuò)產(chǎn)物2μL，混合均勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，94℃30s，54℃30s，72℃40s共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；

5)10g·L^-1瓊脂糖凝膠中電泳；

6)結(jié)果分析：陰性對(duì)照不出條帶，陽性對(duì)照出261bp、157bp兩個(gè)條帶，說明對(duì)照成立，樣品中出現(xiàn)261bp一個(gè)條帶，即為豬瘟流行毒株感染，樣品出261bp、157bp兩個(gè)條帶，即為疫苗毒株。