[發明專利]一種利用釀酒酵母表達抗菌肽G13的方法

無效

• 申請號: 201210073067.9
• 申請日: 2012-03-15
• 公開（公告）號: CN102618551A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 查向東;盧穎虎;惲輝;余忠麗;趙大偉;程林春;李偉霞;耿玉靜;吳敵;梁琳;馬麗娟;車媛媛
• 申請（專利權）人: 安徽希普生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/81;C07K7/08
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技術領域

本發明屬于生物技術和基因工程技術領域，具體的說是涉及一種利用釀酒酵母表達抗菌肽G13的方法。

背景技術

目前，由于抗生素在臨床中被大量使用，所以產生了嚴重的耐藥性問題。人類急需一種新型的藥物來代替抗生素，抗菌肽是一類小分子兩親性多肽，長度一般小于50個氨基酸。來源于自然界中的各種細菌、植物和動物，分布廣泛。因其抗菌機理的獨特性，所以不易產生耐藥性，并且具有水溶性好、熱穩定性強、抗菌譜廣等優點，有望成為傳統抗生素的替代品。顆粒裂解肽(Granulysin)是細胞毒性淋巴細胞CTL和天然殺傷細胞NK的顆粒中含有的一種陽離子抗菌肽，G13的結構域是其中含有一個a-螺旋和loop結構的肽段，由19個氨基酸殘基組成，能夠抑制細菌的活性，而對動物細胞沒有影響，因此在醫療，畜牧，食品等領域具有廣闊的發展前景。

抗菌肽的表達體系目前有以下幾個來源，天然抗菌肽雖然來源廣泛，但是在生物體內產量小，難于分離純化，成本高。化學合成抗菌肽雖然周期短、工程量小、能隨意組合氨基酸殘基，但存在消旋化問題，并且生產成本昂貴。基因工程技術主要通過原核表達和真核表達途徑，具有操作簡單，易于分離和純化，且生產成本低等特點，使其具有規模化、產業化生產的潛力，成為近些年來的研究熱點。

原核表達體系以大腸桿菌表達體系為主，是目前掌握最為成熟的表達系統，其優點是生長周期短，表達產量較高，成本相對低廉。但表達抗菌肽具有以下缺點：原核表達需破碎細胞釋放抗菌肽，增加了生產成本和分離純化的難度；其持續表達可能會對宿主細胞產生毒害作用，添加融合頭融合表達雖然能夠減少毒性，但需切割融合頭，步驟繁瑣；原核表達系統翻譯后加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低。

發明內容

本發明為了克服現有技術存在的不足，提供一種利用釀酒酵母表達抗菌肽G13的方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：一種利用釀酒酵母表達抗菌肽G13的方法，其包括以下步驟：

a、提供抗菌肽G13基因和α信號肽基因，所述抗菌肽G13的基因序列為：CAAAGATCTGTTTCTAATGCTGCTACTAGAGTTTGTAGAACTGGTAGAACTGGTAGATCTAGATGGTAA，利用PCR的方法獲得合成G13序列的模版和引物：所述α信號肽基因序列是以質粒pPICZ?αA中的α信號肽為模版，利用PCR的方法獲得α信號肽片段；

b、構建酵母細胞中表達抗菌肽G13的重組質粒pYES2-α-G13；

c、用重組質粒pYES2-α-G13轉化釀酒酵母INVSC1細胞，所述重組質粒的轉化方法是電轉化法，采用Bio-red公司電轉化儀預設PIC程序；

d、篩選轉化菌，并進行鑒定，所述篩選轉化菌的方法為利用酵母尿嘧啶缺陷型最小合成培養基平板培養；

e、在30℃，200rpm/min的條件下培養轉化菌7～9天，獲得抗菌肽G13，所述抗菌肽G13存在于培養酵母菌INVSC1的菌液上清中；

f、對抗菌肽G13進行鑒定，所述抗菌肽G13采用Tricine-SDS-PAGE作為鑒定方法。

本發明的有益效果是：本發明通過釀酒酵母分泌表達獲得抗菌肽G13，表達的抗菌肽對大腸桿菌DH5α有明顯的抑菌效果。采用酵母表達系統既有原核生物生長快、操作簡單的優點，又有真核生物對蛋白質進行翻譯后修飾的優點，釀酒酵母遺傳背景清楚，易操作；釀酒酵母與日常生活密切，安全無毒素，對生物和環境都不會構成威脅；可進行蛋白翻譯后加工；可進行分泌表達，具有易于純化、工藝簡單和成本較低等優點，本發明的方法對抗菌肽的真核表達研究具有重要意義。

附圖說明

圖1為重組質粒pYES2-α-G13的構建過程示意圖；

圖2為α-factor基因的PCR產物的電泳圖；

圖3為抗菌肽G13基因的PCR產物的電泳圖；

圖4為工程菌誘導上清Tricine-SDS-PAGE電泳圖；

圖5為工程菌誘導上清對大腸桿菌活性檢測圖；

在圖2中，泳道M為DNA?Marker?D(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1為α-factor的PCR產物。

在圖3中，泳道M為DNA?Marker?D(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1為抗菌肽G13的PCR產物。