[發明專利]一種檢測基因突變的方法

有效

• 申請號: 201210072772.7
• 申請日: 2012-03-19
• 公開（公告）號: CN102676654A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 楊懷義;朱鈞;倪挺;劉翟
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種檢測基因突變的方法。

背景技術

病原微生物的不斷變異是造成病原微生物免疫逃逸和抗藥性的根本原因，如能對重要病原微生物流行過程中基因組變異進行檢控及時檢測出抗原表位漂移及抗藥性突變的出現，這對預測病原微生物流行趨勢，及早采取相應的免疫措施或及時更換治療藥物具有重要的作用。

盡管病原微生物變異及抗藥性突變檢測在疾病預防和治療中都具有極高的應用價值，但因缺乏高效、低廉能克服基因組高背景的檢測方法，使其難以應用到臨床實踐中。Sanger測序法雖一直是突變檢測廣泛應用的平臺，但其靈敏度較低，PCR產物混合測序時只能檢測到＞20％的突變，單個克隆測序又費力耗時。

另外，在病原微生物混合感染中病原微生物的分離和鑒定也是臨床實踐中遇到的一大難題。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測基因突變的方法。

本發明提供了一種DNA分子測序的方法，包括如下步驟：

(1)以來自一個待測樣本的雙鏈DNA分子為模板，用單鏈DNA片段甲和單鏈DNA片段乙組成的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物，得到目的待測雙鏈DNA分子(目的待測雙鏈DNA分子即目的基因片段或帶有樣品條碼的目的基因片段)；所述目的待測雙鏈DNA分子由單鏈DNA分子1和單鏈DNA分子2組成，且單鏈DNA分子1和單鏈DNA分子2反向互補；所述單鏈DNA片段甲為所述單鏈DNA分子1的5’端區域；所述單鏈DNA乙包括所述單鏈DNA分子2的5’端區域；

(2)將步驟(1)的PCR擴增產物進行磷酸化；

(3)將步驟(2)的產物單鏈化并與單鏈DNA片段丙及dNTP共孵育，所述單鏈DNA分子1的5’端區域與所述單鏈DNA片段丙的3’端區域配對形成雙鏈，所述單鏈DNA分子1的3’端區域與所述單鏈DNA片段丙的5’端區域配對形成雙鏈；在DNA聚合酶的作用下，所述單鏈DNA分子1的5’端區域與3’端區域通過與所述單鏈DNA片段丙的分子條碼區域互補的核苷酸連接成環；所述單鏈DNA片段丙自5’末端至3’末端依次包括三個區域：所述單鏈DNA分子2的5’端區域、分子條碼區域和所述單鏈DNA分子2的3’端區域；所述分子條碼區域由選自A、T、C和G的10至16個核苷酸組成；

(4)將步驟(3)的產物用核酸外切酶進行消化，去除沒有成環的單鏈DNA分子；

(5)以步驟(4)的產物為模板進行滾環復制；

(6)將步驟(5)的產物的粘末端補平；

(7)將步驟(6)的產物用核酸外切酶進行消化，去除單鏈DNA分子；

(8)將步驟(7)的產物進行超聲破碎并回收與待測雙鏈DNA分子大小近似的片段；

(9)將步驟(8)回收的片段進行末端修復和缺口連接；

(10)將步驟(9)的產物進行磷酸化；

(11)將步驟(10)的產物進行第一次測序；

(12)完成步驟(11)后，以所述單鏈DNA片段甲為測序引物進行第二次測序，讀取分子條碼信息；

(13)將具有相同分子條碼的測序結果進行拼接，每種分子條碼獲得一個具體的測序結果。

所述單鏈DNA片段乙可為所述單鏈DNA分子2的5’端區域；所述單鏈DNA片段丙可由所述單鏈DNA分子2的5’端區域、所述分子條碼區域和所述單鏈DNA分子2的3’端區域組成。

所述待測樣本為兩種以上時，采用相應數量的樣品條碼分別進行標記；所述樣品條碼由選自A、T、C和G的6個核苷酸組成；所述單鏈DNA乙的5’端還具有所述樣品條碼區域；所述單鏈DNA片段丙中，在所述單鏈DNA分子2的5’端區域和所述分子條碼區域之間，還具有與所述樣品條碼區域反向互補的DNA區域；所述方法中，將每種所述待測樣本分別進行所述步驟(1)，混合后進行所述步驟(2)。

所述單鏈DNA片段乙可由所述單鏈DNA分子2的5’端區域和所述樣品條碼區域組成；所述單鏈DNA片段丙可由所述單鏈DNA分子2的5’端區域、與所述樣品條碼區域反向互補的DNA區域、所述分子條碼區域和所述單鏈DNA分子2的3’端區域組成。

以上任一所述方法均可用于檢測基因變異。

所述方法用于檢測單個樣本中的目的基因變異時，將所述方法得到的各個測序結果分別與目的基因的現有序列進行比對，從而判斷目的基因發生的突變；所述來自一個待測樣本的雙鏈DNA分子為來自一個待測樣本的基因組DNA或cDNA。