[發明專利]一種檢測基因突變的方法

有效

• 申請號: 201210072772.7
• 申請日: 2012-03-19
• 公開（公告）號: CN102676654A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 楊懷義;朱鈞;倪挺;劉翟
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.一種DNA分子測序的方法，包括如下步驟：

(1)以來自一個待測樣本的雙鏈DNA分子為模板，用單鏈DNA片段甲和單鏈DNA片段乙組成的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物，得到目的待測雙鏈DNA分子；所述目的待測雙鏈DNA分子由單鏈DNA分子1和單鏈DNA分子2組成，且單鏈DNA分子1和單鏈DNA分子2反向互補；所述單鏈DNA片段甲為所述單鏈DNA分子1的5’端區域；所述單鏈DNA乙包括所述單鏈DNA分子2的5’端區域；

(2)將步驟(1)的PCR擴增產物進行磷酸化；

(3)將步驟(2)的產物單鏈化并與單鏈DNA片段丙及dNTP共孵育，所述單鏈DNA分子1的5’端區域與所述單鏈DNA片段丙的3’端區域配對形成雙鏈，所述單鏈DNA分子1的3’端區域與所述單鏈DNA片段丙的5’端區域配對形成雙鏈；在DNA聚合酶的作用下，所述單鏈DNA分子1的5’端區域與3’端區域通過與所述單鏈DNA片段丙的分子條碼區域互補的核苷酸連接成環；所述單鏈DNA片段丙自5’末端至3’末端依次包括三個區域：所述單鏈DNA分子2的5’端區域、分子條碼區域和所述單鏈DNA分子2的3’端區域；所述分子條碼區域由選自A、T、C和G的10至16個核苷酸組成；

(4)將步驟(3)的產物用核酸外切酶進行消化，去除沒有成環的單鏈DNA分子；

(5)以步驟(4)的產物為模板進行滾環復制；

(6)將步驟(5)的產物的粘末端補平；

(7)將步驟(6)的產物用核酸外切酶進行消化，去除單鏈DNA分子；

(8)將步驟(7)的產物進行超聲破碎并回收與待測雙鏈DNA分子大小近似的片段；

(9)將步驟(8)回收的片段進行末端修復和缺口連接；

(10)將步驟(9)的產物進行磷酸化；

(11)將步驟(10)的產物進行第一次測序；

(12)完成步驟(11)后，以所述單鏈DNA片段甲為測序引物進行第二次測序，讀取分子條碼信息；

(13)將具有相同分子條碼的測序結果進行拼接，每種分子條碼獲得一個具體的測序結果。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述待測樣本為兩種以上，并采用相應數量的樣品條碼分別進行標記；所述樣品條碼由選自A、T、C和G的6個核苷酸組成；所述單鏈DNA乙的5’端還具有所述樣品條碼區域；所述單鏈DNA片段丙中，在所述單鏈DNA分子2的5’端區域和所述分子條碼區域之間，還具有與所述樣品條碼區域反向互補的DNA區域；所述方法中，將每種所述待測樣本分別進行所述步驟(1)，混合后進行所述步驟(2)。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述單鏈DNA片段乙為所述單鏈DNA分子2的5’端區域；所述單鏈DNA片段丙由所述單鏈DNA分子2的5’端區域、所述分子條碼區域和所述單鏈DNA分子2的3’端區域組成。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于：所述單鏈DNA片段乙由所述單鏈DNA分子2的5’端區域和所述樣品條碼區域組成；所述單鏈DNA片段丙由所述單鏈DNA分子2的5’端區域、與所述樣品條碼區域反向互補的DNA區域、所述分子條碼區域和所述單鏈DNA分子2的3’端區域組成。

5.權利要求1至4中任一所述方法在檢測基因變異中的應用。

6.權利要求1或3所述的方法的如下應用：檢測單個樣本中的目的基因變異；所述應用中，將所述方法得到的各個測序結果分別與目的基因的現有序列進行比對，從而判斷目的基因發生的突變；所述來自一個待測樣本的雙鏈DNA分子為來自一個待測樣本的基因組DNA或cDNA。

7.權利要求2或4所述的方法的如下應用：檢測多個樣本中的目的基因變異；所述應用中，將所述方法得到的各個測序結果分別與目的基因的現有序列進行比對，從而判斷目的基因發生的突變；所述來自一個待測樣本的雙鏈DNA分子為來自一個待測樣本的基因組DNA或cDNA。