[發(fā)明專(zhuān)利]一種快速檢測(cè)重組蛋白表達(dá)量的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210072148.7
• 申請(qǐng)日: 2012-03-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102654504A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李彬;李威
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 生工生物工程（上海）有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 上海脫穎律師事務(wù)所 31259
• 代理人: 李強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組蛋白表達(dá)過(guò)程中蛋白表達(dá)量的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

DNA的重組技術(shù)是基因工程的核心技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的多個(gè)方面并給生命科學(xué)帶來(lái)了革命性的變化，促進(jìn)了生命科學(xué)領(lǐng)域研究和應(yīng)用的進(jìn)步。其中，利用某種生物或細(xì)胞來(lái)大量表達(dá)特定的目標(biāo)蛋白，也就是重組蛋白的表達(dá)是DNA重組技術(shù)的重要應(yīng)用之一。

蛋白質(zhì)是生命組成中的重要物質(zhì)，是生物體行使各種生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與核酸以及其他細(xì)胞組分之間的相互作用，蛋白質(zhì)等生物大分子本身的結(jié)構(gòu)與功能的改變均對(duì)生物體的生命活動(dòng)產(chǎn)生重要的影響。重組蛋白表達(dá)技術(shù)的出現(xiàn)使得人們可以利用基因工程的手段產(chǎn)生天然的或任意設(shè)計(jì)的核酸序列，進(jìn)而大量獲得過(guò)去難以獲得的生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)，從而研究其結(jié)構(gòu)與功能。更重要的，還可以通過(guò)突變的手段獲得“改造”以后的蛋白質(zhì)，為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，揭露生命的本質(zhì)提供了強(qiáng)有力的手段。

目前發(fā)展起來(lái)的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)有許多，根據(jù)表達(dá)蛋白的宿主的不同可以分為原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物表達(dá)系統(tǒng)以及不需要宿主的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。不同的表達(dá)系統(tǒng)有各自的特點(diǎn)，往往需要根據(jù)目標(biāo)蛋白的性質(zhì)和后續(xù)的應(yīng)用進(jìn)行選擇。原核表達(dá)系統(tǒng)是利用特定的大腸桿菌工程菌株作為宿主菌來(lái)表達(dá)外源重組蛋白的一個(gè)系統(tǒng)，由于其宿主細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化方便，表達(dá)成本相對(duì)較低等特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。

在原核細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白主要有以下幾個(gè)環(huán)節(jié)：A、從生命體內(nèi)擴(kuò)增或根據(jù)序列人工合成目的基因；B、利用克隆的手段將該基因片段裝到表達(dá)載體中，表達(dá)載體通常是一段與宿主細(xì)胞相容的、可以短時(shí)間存在于細(xì)胞中、或可以在宿主細(xì)胞中繁殖和擴(kuò)增、或可以整合至宿主細(xì)胞基因組DNA中的特殊的DNA分子，該分子上的一些具有特定序列和特殊作用的片段如啟動(dòng)子、終止子、調(diào)控序列等與目的基因形成一個(gè)可以讓目的基因在宿主細(xì)胞體內(nèi)完成轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程的表達(dá)盒；C、為了確保目的基因和其他相關(guān)序列的正確性，該表達(dá)載體需要通過(guò)DNA序列測(cè)定完成驗(yàn)證。為了獲得大量的載體，在這個(gè)過(guò)程中往往需要將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入克隆菌株中進(jìn)行保存和擴(kuò)增；D、將序列得到確認(rèn)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入特定的宿主細(xì)胞(如大腸桿菌，酵母，昆蟲(chóng)細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞等)中，在一定條件下誘導(dǎo)表達(dá)載體中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行表達(dá)；E、篩選獲得表達(dá)量最高的細(xì)胞；F、將該細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)并進(jìn)行后續(xù)的純化等工作。

在這些環(huán)節(jié)中，前期載體構(gòu)建的步驟主要利用基因工程中的工具酶進(jìn)行擴(kuò)增、酶切、連接等一系列的過(guò)程來(lái)完成，整個(gè)技術(shù)已相對(duì)成熟，目前也已經(jīng)有多種具有不同特性的表達(dá)載體可以選擇。后續(xù)的純化工作需要根據(jù)不同的目標(biāo)蛋白的特性制定純化策略，盡管目前有多種融合標(biāo)簽可以幫助進(jìn)行蛋白純化，但需要進(jìn)一步純化時(shí)，純化方案需要的定制程度仍然比較高。

外源重組蛋白在一個(gè)宿主中的表達(dá)以及表達(dá)量往往受到眾多因素的影響，比如質(zhì)粒的拷貝數(shù)、啟動(dòng)子與誘導(dǎo)方式的選擇、重組蛋白的親疏水性、重組蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的生理影響等，甚至宿主菌的生長(zhǎng)狀態(tài)或其基因組上的細(xì)微突變均會(huì)影響到重組蛋白的表達(dá)與否，表達(dá)量的高低。因此，在進(jìn)行大量表達(dá)之前，對(duì)可能的克隆進(jìn)行篩選，獲得一個(gè)表達(dá)量高的克隆對(duì)于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)非常關(guān)鍵。

在現(xiàn)行的研究方法中，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌以后，往往需要先通過(guò)PCR等手段驗(yàn)證重組載體是否轉(zhuǎn)入宿主菌中，隨后通過(guò)小量培養(yǎng)陽(yáng)性克隆并進(jìn)行小量表達(dá)實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選和比較不同克隆之間的表達(dá)量。該過(guò)程操作繁瑣，重新培養(yǎng)也需要額外的等待時(shí)間，而且很難將篩選規(guī)模進(jìn)一步擴(kuò)大。

為了解決這一問(wèn)題，采用本發(fā)明的方法可以在克隆平板上直接進(jìn)行篩選，每次可以同時(shí)檢測(cè)上百個(gè)克隆，大大提高了篩選的效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種快速檢測(cè)重組蛋白表達(dá)量的方法。

本發(fā)明首先將含有目標(biāo)蛋白表達(dá)盒的載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株后涂布于平板培養(yǎng)基上并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，待單克隆菌落生長(zhǎng)至一定大小后，將平板上的克隆影印至印跡膜上。隨后，將菌體在膜上裂解，使克隆中的蛋白固定至印跡膜上，并用針對(duì)目標(biāo)蛋白或載體上的特定標(biāo)簽的抗體進(jìn)行Western?blotting檢測(cè)，Western?blotting檢測(cè)中，各個(gè)斑所在位置處的信號(hào)強(qiáng)度即反映了該克隆中目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。進(jìn)一步可以從原來(lái)的平板上或復(fù)制的平板上找到表達(dá)量最高的克隆，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

具體地，本發(fā)明快速檢測(cè)重組蛋白表達(dá)量的方法，包括以下步驟：