[發明專利]鵝VIP基因cDNA、DNA和PHI編碼序列克隆的方法

無效

• 申請號: 201210071270.2
• 申請日: 2012-03-19
• 公開（公告）號: CN102604933A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 何大乾;劉毅;王惠影;吳斌;吳華莉
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及的是一種鵝VIP基因cDNA、DNA和PHI編碼序列克隆的方法。

背景技術

繁殖性能是家禽業生產中重要的經濟性狀之一，但是，大多數品種的鵝都保持著較強的就巢行為，嚴重影響其繁殖能力。雖然家禽的就巢行為是可遺傳的，通過常規選育能降低和減少其就巢行為和就巢時間，但是，由于其就巢性狀的遺傳力很低，常規選育方法很難徹底根除其就巢性，特別是隨著選育世代的增加，遺傳進展變的十分緩慢。除此，家禽就巢性還與其自身的生殖內分泌激素水平變化密切相關，近年來，國內外學者圍繞家禽就巢生殖內分泌展開大量研究，闡明家禽就巢行為發生、維持和結束的內分泌機制。最終，通過常規選育結合生殖激素的調控來阻斷家禽就巢行為的發生，提高其繁殖能力。

催乳素(Prolactin，PRL)是家禽就巢行為發生和維持的關鍵激素。Lea(1981)證明血液中高水平的PRL是引起和維持母禽就巢行為的主要原因。隨后，El?Halawani(1999)證明活性血管腸肽(Vasoactive?Intestinal?Peptide，VIP)是家禽PRL的釋放因子，能促進垂體細胞分泌PRL，調控其就巢行為。并且，其他PRL調控因子(如5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(Dopamine，DA))也是通過VIP來調節PRL的分泌。由此可見，VIP在調節家禽PRL分泌和就巢行為的發生中起到至關重要的作用。

大多數哺乳動物的VIP基因序列和其結構功能都有大量報道。相對于哺乳動物，家禽的VIP基因序列研究較少，只有火雞和雞的VIP基因序列和結構有一些報道，鴨的VIP基因有部分片段已經克隆測序，鵝VIP基因序列和結構還未見報道。

目前，由于鵝VIP基因序列和結構還未見報道，可用的基礎資料匱乏，這給運用PCR和RACE技術獲得該基因cDNA、DNA和PHI編碼序列帶來不小困難，阻礙后續的該基因結構、功能、調控通路等研究。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供鵝VIP基因cDNA、DNA和PHI編碼序列克隆的方法。

本發明的技術方案如下：

一種鵝VIP基因cDNA、DNA和PHI編碼序列克隆的方法，用于擴展鵝VIP基因編碼區部分序列的特異性引物為VIP1/VIP2，擴增鵝VIP基因cDNA5′序列的特異性巢式引物為GSP2和GSP3，3′端的特異性引物為GSP1，將測序的片段拼接，獲得鵝VIP基因cDNA全長序列；用所獲得的鵝VIP基因cDNA序列作為模板，設計擴增鵝VIP基因DNA序列的引物，首先篩選到VIP5/VIP6和VIP7/VIP8特異性引物，擴增出鵝VIP基因DNA兩個片段，然后根據鵝VIP基因cDNA序列和所獲得的DNA片段設計出VIP3/VIP4引物；結合鵝DNA中PHI樣編碼序列和cDNA序列，用Primer?premier?5.0設計兩對鵝PHI編碼特異性引物PHI1/PHI2和PHI3/PHI4，用PHI特異性引物擴增鵝PHI編碼序列。

所述的方法，擴展鵝VIP基因編碼區部分序列的PCR反應體系及條件：PCR反應總體積為50ul，其中2×Master?Mix?Taq25ul，cDNA模板4ul，10μM上下游引物各1.5ul，ddH2O18ul；PCR反應程序如下：94℃預變性5min，94℃變性30sec，60℃退火45sec，72℃延長45sec，從第二步開始循環38次，最后72℃延長10min。

所述的方法，擴增鵝VIP基因DNA序列的PCR反應體系及條件：PCR反應總體積為50ul，其中Premix?LATaq(Takara)30ul，DNA模板1ul，上下游引物(20μM)各1ul，ddH2O17ul；PCR反應程序如下：94℃預變性5min，94℃變性1min，引物特異退火溫度：VIP3/VIP4引物的退火為63℃、VIP5/VIP6和VIP7/VIP8引物的退火為60℃，退火90sec，72℃延長4min，從第二步開始循環38次，最后72℃延長20min。