[發(fā)明專利]鵝VIP基因cDNA、DNA和PHI編碼序列克隆的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210071270.2
• 申請日: 2012-03-19
• 公開（公告）號: CN102604933A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何大乾;劉毅;王惠影;吳斌;吳華莉
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種鵝VIP基因cDNA、DNA和PHI編碼序列克隆的方法，其特征在于，用于擴(kuò)展鵝VIP基因編碼區(qū)部分序列的特異性引物為VIP1/VIP2，擴(kuò)增鵝VIP基因cDNA5′序列的特異性巢式引物為GSP2和GSP3，3′端的特異性引物為GSP1，將測序的片段拼接，獲得鵝VIP基因cDNA全長序列；用所獲得的鵝VIP基因cDNA序列作為模板，設(shè)計擴(kuò)增鵝VIP基因DNA序列的引物，首先篩選到VIP5/VIP6和VIP7/VIP8特異性引物，擴(kuò)增出鵝VIP基因DNA兩個片段，然后根據(jù)鵝VIP基因cDNA序列和所獲得的DNA片段設(shè)計出VIP3/VIP4引物；結(jié)合鵝DNA中PHI樣編碼序列和cDNA序列，用Primer?premier?5.0設(shè)計兩對鵝PHI編碼特異性引物PHI1/PHI2和PHI3/PHI4，用PHI特異性引物擴(kuò)增鵝PHI編碼序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，擴(kuò)展鵝VIP基因編碼區(qū)部分序列的PCR反應(yīng)體系及條件：PCR反應(yīng)總體積為50ul，其中2×Master?Mix?Taq25ul，cDNA模板4ul，10μM上下游引物各1.5ul，ddH2O18ul；PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30sec，60℃退火45sec，72℃延長45sec，從第二步開始循環(huán)38次，最后72℃延長10min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，擴(kuò)增鵝VIP基因DNA序列的PCR反應(yīng)體系及條件：PCR反應(yīng)總體積為50ul，其中Premix?LA?Taq30ul，DNA模板1ul，20μM上下游引物各1ul，ddH2O17ul；PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，引物特異退火溫度：VIP3/VIP4引物的退火為63℃、VIP5/VIP6和VIP7/VIP8引物的退火為60℃，退火90sec，72℃延長4min，從第二步開始循環(huán)38次，最后72℃延長20min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，擴(kuò)增鵝PHI編碼序列的PCR反應(yīng)體系和條件如下：PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)總體積為50ul，其中2×Master?Mix?Taq25ul，cDNA模板6ul，10μM上下游引物各1.5ul，ddH2O16ul；PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30sec，引物特異退火溫度：PHI1/PHI2引物的退火為63℃、PHI3/PHI4引物的退火為65℃，退火45sec，72℃延長45sec，從第二步開始循環(huán)38次，最后72℃延長10min。