[發(fā)明專(zhuān)利]一種棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210071182.2
• 申請(qǐng)日: 2012-03-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102577979A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳玉梁;陳子萱;羅俊杰;李忠旺;張敏敏;劉新星;厚毅清;王紅梅;裴懷弟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): A01H4/00
• 分類(lèi)號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 北京中恒高博知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11249
• 代理人: 高松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種植物領(lǐng)域組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，具體涉及棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，彩色棉的纖維具有天然色彩，用它進(jìn)行紡織避免了化工染料對(duì)人體的毒害和對(duì)棉纖維自身優(yōu)良品質(zhì)的破壞，隨著人們生活水平的日益提高和紡織工業(yè)的飛速發(fā)展使其倍受青睞。但彩色棉由于受到產(chǎn)量低、產(chǎn)業(yè)化加工規(guī)模有限等因素的限制，未能大面積示范推廣，利用常規(guī)育種手段進(jìn)行品質(zhì)改良具有難度，在一定程度上影響了彩色棉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉育種的突破極大地促進(jìn)了世界棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，同時(shí)使轉(zhuǎn)基因育種作為傳統(tǒng)育種的重要補(bǔ)充手段得到育種家的公認(rèn)，拓展建立不同彩色棉品種類(lèi)型的再生體系，是利用轉(zhuǎn)基因手段改良彩色棉品種和品質(zhì)的關(guān)鍵所在，對(duì)彩色棉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要研究?jī)r(jià)值。

利用遺傳工程技術(shù)改良棉花品種能夠提高棉花的種植效益，雖然棉花生物技術(shù)育種獲得了突破性進(jìn)展，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉成功應(yīng)用于棉花生產(chǎn)，但仍存在許多不足，棉花育種研究仍然存在著很多障礙，其中植株再生的高效體系是棉花轉(zhuǎn)基因育種的先決條件，獲得胚性愈傷組織是植株再生的前提，也是能否建立再生體系的關(guān)鍵，如何促進(jìn)胚性愈傷組織的分化、體細(xì)胞胚成熟、提高再生率一直是眾多研究者所要突破的難題。棉花遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的復(fù)雜性(難重復(fù)、轉(zhuǎn)化率低)和轉(zhuǎn)基因棉花的農(nóng)藝性狀的變異等，這些問(wèn)題都是棉花生物技術(shù)育種研究的瓶頸，目前獲得的再生體系具有很強(qiáng)的基因依賴(lài)性。我們首次開(kāi)展隴棕棉系列品種的再生研究，通過(guò)對(duì)棕色棉組織培養(yǎng)再生各個(gè)階段關(guān)鍵因素的研究，獲得了棕色棉胚性愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中的各種影響因素的最適培養(yǎng)條件，為彩色棉轉(zhuǎn)基因育種提供了技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，克服了棕色棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生的困難，提供了一種棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，包括有以下步驟：

1)棕色棉種子人工脫殼后，再經(jīng)過(guò)消毒處理，得到無(wú)菌棕色棉種子，再將無(wú)菌棕色棉種子放入搖床中遮光懸浮暗培養(yǎng)24-36小時(shí)，在胚根生長(zhǎng)至0.8-1.2cm時(shí)，接種于1/2所有元素減半的MSB培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3-5天，得到2-4cm長(zhǎng)的無(wú)菌苗下胚軸；

2)將步驟1)得到的無(wú)菌苗下胚軸在無(wú)菌條件下切為5-8mm小段，并置于棕色棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，得到初級(jí)培養(yǎng)棕色棉愈傷組織；

3)將步驟2)得到的初級(jí)培養(yǎng)棕色棉愈傷組織轉(zhuǎn)接至棕色棉愈傷組織增殖培養(yǎng)基并繼代培養(yǎng)2次，繼代培養(yǎng)周期為25天，得到增殖后棕色棉愈傷組織；

4)將步驟3)得到的增殖后棕色棉愈傷組織轉(zhuǎn)入棕色棉愈傷組織分化培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)2-3次，繼代培養(yǎng)周期為25天，得到胚性愈傷組織；

5)將步驟4)得到的胚性愈傷組織置于棕色棉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。

上述棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟1)中，

消毒處理的過(guò)程為：棕色棉種子先以0.1％的貢溶液滅菌8-12分鐘，再以無(wú)菌水沖洗5-8遍，最后加無(wú)菌水在搖床懸浮培養(yǎng)24-36小時(shí)至種子胚根伸長(zhǎng)；

搖床的溫度為27-29℃，速度為120rpm。

上述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟2)中，棕色棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為按照以下比例加入了1.9-3.8g/L?KNO₃、0.75g/L?MgCl₂，同時(shí)附加有0.3-0.8mg/L?N6-異戊烯腺嘌呤和0.5-1.5mg/L吲哚丁酸的MSB培養(yǎng)基。

上述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟3)中，棕色棉愈傷組織增殖培養(yǎng)基為按照以下比例加入了0.1-0.5mg/L?N6-異戊烯腺嘌呤和0.4-1mg/L吲哚丁酸的MSB培養(yǎng)基。

上述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟4)中，棕色棉愈傷組織分化培養(yǎng)基為按照以下比例加入了0.05-0.2mg/L?N6-異戊烯腺嘌呤和0.1-0.5mg/L吲哚丁酸的MSB培養(yǎng)基。

上述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟5)中，棕色棉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MSB培養(yǎng)基，其中NH₄NO₃濃度減半，為0.825g/L。