[發明專利]一種新型的超高分辨光電融合顯微成像系統

有效

• 申請號: 201210069941.1
• 申請日: 2012-03-16
• 公開（公告）號: CN103308496A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 徐濤;羅志勇;紀偉;倉懷興;孟濤;張翔;季剛;付彥輝;賈策
• 申請（專利權）人: 徐濤;羅志勇;紀偉
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G02B21/36;G02B21/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

系統領域：?

本發明涉及光學顯微成像和電子顯微成像技術領域，尤其涉及一種采用熒光顯微鏡系統和掃描電鏡結合的光電融合顯微成像系統。?

背景技術：

電子顯微鏡技術是結構生物學研究的重要研究手段，使生物學家能夠在nm尺度研究生物的超細微結構及其與功能的關系，但是無法明確不同超微結構內的生物分子種類和分布——雖然免疫膠體金技術可以對目標分子在超微結構上進行標記，但由于其低標記效率、低分辨率和非特異性標記等缺點而限制了其廣泛的應用。?

熒光成像是現代生命科學研究的重要研究手段，可以獲得被研究對象在生物體系中定位信息、功能信息和反應過程的動態信息。特別是超高分辨率熒光成像技術的發展，已突破衍射極限的限制，獲得nm、亞nm的定位精度。如單光子干涉光敏顯微鏡儀(interferometric?Photoactivated?Localization?Microscopy，iPALM)、光敏定位顯微鏡(Photoactivated?Localization?Microscopy，PALM)、隨機光學重構顯微鏡(Stochastic?Optical?Reconstruction?Microscopy，STORM)、受激發射耗盡(Stimulated?Emission?Depletion，STED)顯微鏡、飽和結構照明顯微鏡(Saturated?Structured?Illumination?Microscopy，SSIM)等，它們實現了在細胞器(納米級)水平的分辨能力，而且對生物樣品中的研究目標具有特異性標記和高精度的定位識別能力，彌補了電子顯微成像不能識別特定的生物分子的不足。?

光電融合成像技術即通過超分辨率光學顯微技術對目標分子進行納米分辨率定位，通過電鏡三維重構技術獲取細胞指定部位的三維結構，將定位信息和結構信息進行整合和處理，從而獲得大量關于目標分子在細胞原位的三維結構信息，甚至最終可以繪制出精細的細胞和生物個體(如線蟲)內生物分子的分布地圖。2006年Betzig首次在冷凍切片上觀察到了蛋白質納米尺度的超高分辨定位。2010年Shigeki等人在普通切片上實現了PALM與電鏡的結合，在線蟲切片的電鏡照片中觀察到了線粒體外膜蛋白的精確定位。目前市面上有一款激光共聚焦光學顯微鏡和電鏡成像的綜合解決方案。該方案是先利用激光共聚焦成像，然后將樣品用電子顯微鏡成像，該解決方案的核心是利用特制的樣品托對被成像區域定位，從而保證共聚焦顯微鏡和電子顯微鏡觀察的是同一區域，但熒光顯微成像、電子顯微成像技術是在兩個獨立的互不相關的系統，需要人工實現樣品的轉移。?

在實現本發明的過程中，申請人意識到目前現有技術存在以下技術缺陷：?

1.熒光成像、切片系統和電子成像技術是相互分割的、獨立的系統，沒有形成一體化的技術，工作中需要人工干預，不可避免地引入人為干擾。?

2.無法對大樣品連續進行高精度熒光成像、電鏡成像。?

發明內容：

(一)要解決的技術問題?

為解決上述缺陷，本發明提供了一種采用高分辨熒光顯微鏡系統和掃描電鏡系統結合的光電融合顯微成像系統，使之能對大樣品自動高效采集高分辨率熒光圖像和掃描電子顯微圖像，自動將定位信息和結構信息進行整合和處理。?

(二)技術方案?

根據本發明的一個方面，提供了一種采用熒光顯微鏡系統和掃描電鏡系統結合的光電融合顯微成像系統。該光電融合顯微成像系統包括：熒光顯微鏡系統、樣品轉移系統、樣品切片系統和掃描電鏡系統。熒光顯微鏡系統包括光源系統、掃描擴束系統、熒光成像系統，其中：掃描擴束系統對激光進行擴束，并使激光沿著x軸、y軸方向進行掃描；熒光成像系統用于激發樣品并對樣品激發的熒光成像；掃描電鏡系統，用于對樣品進行電子束成像。樣品轉移系統用于樣品在熒光顯微鏡系統和掃描電鏡系統之間轉移，實現超高分辨率熒光成像和掃描電子成像。樣品切片系統對厚樣品切片，使掃描電鏡和熒光顯微鏡能對樣品內部成像。?

優選地，本光電融合顯微成像系統中，光源系統包括多組不同波長的激光器、分光鏡和二色鏡。其中：激光器，用于輸出預設波長的準直激光；分光鏡和二色鏡，用于將激光耦合進掃描器。?

優選地，光源系統可由多個波長的激光器組成，這些激光器發出的激光，通過分光鏡耦合成共軸的光束進入聲光調制濾光器(acousto-optic?tunable?filter簡稱AOTF)，AOTF可以選取一個或多個波長激光通過并對激光強度進行控制。?