[發明專利]銀杏內生真菌的分離純化方法

有效

• 申請號: 201210067829.4
• 申請日: 2012-03-14
• 公開（公告）號: CN102676398A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 花日茂;郭正彥;柏鈺;操海群;吳祥為;李學德;唐俊
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/77
• 代理公司: 合肥金安專利事務所 34114
• 代理人: 金惠貞

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，特別涉及一種其發酵物具有抑制植物病原真菌的活性的微生物。

背景技術

在農業生產過程中控制農作物病蟲草害的主要手段是化學農藥防治，其對減輕病蟲草危害，保證糧食豐產豐收，起到積極的作用。但是由于自然界生物之間相互依存、相互制約，過分依賴化學農藥的毒殺作用，產生一些地區發生盲目濫施農藥的現象，特別是一些殘效期長和毒性大的農藥使用，導致一系列食品安全、人類健康和生存環境問題。目前化學防治的危害逐步被人們所認識，研制安全、高效、環保的新型農藥已成為發展的方向和研究的主題。生物農藥因對人、畜低危險性，使用安全，對環境友好，不易產生抗性等優點，成為新農藥產業發展的熱點和重點。

植物內生真菌(Endophytic?fungi)是指生活在植物組織內或生活史中的某一階段生活在植物組織內，對植物組織不引起明顯變化的真菌，包括那些生活史中某一階段能營造表生生活的腐生菌，對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原菌(Latent?pathogens)和菌根菌(Mycorhiza?fungi)。植物內生真菌具有明顯的多樣性和普遍性。在目前所有研究過內生真菌的植物中，都有其存在，少則十幾種，多則近百種。植物內生真菌與宿主植物長期的共生過程中，構建了內生真菌特殊的生長環境，使得內生真菌能夠產生許多與結構新穎、生理活性獨特的天然化合物。具有安全、無殘留、不在人畜體內積累、防治效果專一等優點，為農藥先導化合物和新型生物農藥的研究和應用開拓了美好前景。當前利用植物中分離的內生真菌獲得生理活性物質已成為研究熱點，已有多項研究表明植物內生真菌能產生新型的抑菌活性的物質。如White等從禾本科植物中分離的內生真菌枝頂孢(Acremonium?coenophilum)對多種體外培養的農作物病原真菌有抑制作用。Findlay從黑云杉(Picea?mariana)中分離到內生真菌(Conoplea?elegantala)的液體發酵產物中分離出兩個新的苯并吡咯類活性成分，對由絲核菌(Rhizoctonia?spp.)和鐮刀菌(Fusarium?spp.)引起的病害有很好的防效，水稻立枯病、惡苗病等病害有良好的防治作用。顧愛國從苦皮藤內生真菌(Fusarium?proliferatum)中分離到恩鐮孢菌素(eniatinns)類化合物，其對植物病原真菌菌絲生長和孢子萌發均有顯著抑制作用。

銀杏(Ginkgo?biloba?L.)素有裸子植物“活化石”和“植物界熊貓”之稱，是中國特有的珍貴樹種，在漫長的生長期中幾乎不感染病蟲害，壽命極長。根據內共生理論推斷，銀杏中很有可能存在著特殊的內生真菌，通過產生特殊的次生代謝產物幫助增強銀杏的抗病害能力。

發明內容

本發明的目的在于提供一種分離自中國安徽省合肥市銀杏(Ginkgo?biloba?L)植物活體中，且其發酵產物具有較強的抑制植物病原真菌活性的微生物，即銀杏內生真菌。

本發明所描述的銀杏內生真菌命名為腐皮鐮孢菌(Fusarium?solani?T-7)，現保藏在國家知識產權局指定的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為CGMCC?No.5089。

本發明所描述的銀杏內生真菌系從中國安徽省合肥市銀杏(Ginkgo?biloba?L)植物活體中分離得到的。

本發明銀杏內生真菌的具體分離純化操作步驟如下：

(1).銀杏組織的準備：采集銀杏的根、莖、葉；

(2).銀杏組織的表面消毒與無菌檢測：將步驟(1)采集的根依次在濃度70％的酒精中浸泡1min、在濃度0.2％的次氯酸鈉溶液中浸泡2min；將采集的莖依次在濃度70％的酒精中浸泡50s、在濃度0.2％的次氯酸鈉溶液中浸泡90s；將采集的葉片依次在濃度70％的酒精中浸泡40s、在濃度0.2％的次氯酸鈉溶液中浸泡60s；將浸泡過的根、莖、葉用無菌水沖洗3次，陰干，得到消毒后的根、莖、葉；用消毒手術刀將消毒后的根、莖、葉分別切成0.5cm×0.5cm大小的根塊、莖塊、葉塊；接著將一部分根塊、莖塊、葉塊直接種植于第一塊馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，溫度24～28℃恒溫培養，培養3～7天；