[發明專利]銀杏內生真菌的分離純化方法

有效

• 申請號: 201210067829.4
• 申請日: 2012-03-14
• 公開（公告）號: CN102676398A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 花日茂;郭正彥;柏鈺;操海群;吳祥為;李學德;唐俊
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/77
• 代理公司: 合肥金安專利事務所 34114
• 代理人: 金惠貞

1.銀杏內生真菌的分離純化方法，其特征在于：

（1）.銀杏組織的準備：采集銀杏的根、莖、葉；

（2）.銀杏組織的表面消毒與無菌檢測：將步驟（1）采集的根依次在濃度70%的酒精中浸泡1?min、在濃度0.2%的次氯酸鈉溶液中浸泡2min；將采集的莖依次在濃度70%的酒精中浸泡50s、在濃度0.2%的次氯酸鈉溶液中浸泡90s；將采集的葉片依次在濃度70%的酒精中浸泡40s、在濃度0.2%的次氯酸鈉溶液中浸泡60s；將浸泡過的根、莖、葉用無菌水沖洗3次，陰干，得到消毒后的根、莖、葉；用消毒手術刀將消毒后的根、莖、葉分別切成?0.5?cm×0.5?cm大小的根塊、莖塊、葉塊；接著將一部分根塊、莖塊、葉塊直接種植于第一塊馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，溫度24～28℃恒溫培養，培養3～7天；

將另一部分根塊、莖塊、葉塊進行無菌檢測：采用組織印跡法，將根塊、莖塊、葉塊置于第二塊馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板上輕輕滾動或緊貼培養基放置2?min，接著移去根塊、莖塊、葉塊，在溫度28℃恒溫培養，培養7天，無雜菌長出即說明消毒后的根塊表面、莖塊表面、葉塊表面無菌；所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基配方為：馬鈴薯?200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水1升；使用前馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基在溫度121℃、壓力0.1MPa下滅菌30?min；

（3）.銀杏組織內生真菌的分離培養：當步驟（2）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板上銀杏的根塊、莖塊、葉塊周圍長出菌絲時，采用尖端菌絲挑取法，接種于第三塊馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，溫度24～28℃恒溫培養，培養3～10天，長出完整菌落，即為銀杏內生真菌；銀杏內生真菌的菌落質地較薄，菌落表面絨狀，中央為淡黃色，四周為白色，無色素產生，背面帶黃色至黃褐色；?

本發明所述的銀杏內生真菌菌株ITS基因組由597個堿基（bp）組成，系列如下：

1????????TTCGMCCGGC?CTTATTGATA?TGCTTAAGTT?CAGCGGGTAT?TCCTACCTGA

51???????TTCGAGGTCA?ACATTCAGAA?GTTGGGTGTT?TTACGGCGTG?GCCGCGCCGC

101??????TCTCCAGTTG?CGAGGTGTTA?GCTACTACGC?AATGGAAGCT?GCGGCGGGAC

151??????CGCCACTGTA?TTTGGGGGAC?GGCGTTGTGC?CCGCAGGGGG?CTTCCGCCGA

201??????TCCCCAACGC?CAGGCCCGGG?GGCCTGAGGG?TTGTAATGAC?GCTCGAACAG

251??????GCATGCCCGC?CAGAATACTG?GCGGGCGCAA?TGTGCGTTCA?AAGATTCGAT

301??????GATTCACTGA?ATTCTGCAAT?TCACATTACT?TATCGCATTT?CGCTGCGTTC

351??????TTCATCGATG?CCAGAGCCAA?GAGATCCGTT?GTTGAAAGTT?TTAATTTATT

401??????TGCTTGTTTA?CTCAGAAGAA?ACATTATAGA?AACAGAGTTA?GGGGGTCCTC

451??????TGGCGGGGGC?GGCCCGTGTT?ACGGGGCCGT?CTGTTCCCGC?CGAGGCAACG

501??????TTATAGGTAT?GTTCACAGGG?TTGATGAGTT?GTATAACTCG?GTAATGATCC

551??????CTCCGCTGGT?TCACCAACGG?AGACCTTGTT?ACGACTTTTT?ACTTCCA

本發明所述的銀杏內生真菌命名為腐皮鐮孢菌（Fusarium?solani?T-7)，現保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年7月20日，保藏編號為CGMCC?No.5089。