[發(fā)明專利]一種用于生物學活性測定的質(zhì)粒及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210066996.7
• 申請日: 2012-03-14
• 公開（公告）號: CN103305540A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設計）人: 王晶翼;朱蕾;孫麗霞;車立平;王克波;李劍鳳;劉克玲
• 申請（專利權）人: 齊魯制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/68;C12Q1/02;G01N21/31
• 代理公司: 濟南金迪知識產(chǎn)權代理有限公司 37219
• 代理人: 趙龍群

技術領域

本發(fā)明涉及一種用于生物學活性測定的質(zhì)粒及其制備方法，屬于生物技術技術領域。

背景技術

生物學活性評價是生物制品質(zhì)量最客觀、有效的指標，因此建立生物制品的生物學活性檢測方法也成為質(zhì)量研究的重點之一。目前，已報道的生物學活性測定方法主要是利用商業(yè)化的細胞株，其特點是細胞株的專一性不好，用于生物性活性測定時常常遇到樣品對細胞株的依賴性較差或樣品對細胞株的依賴性缺乏梯度等問題，給樣品的生物學活性測定過程帶來很多限制因素。而生物學活性是評價生物制品質(zhì)量最重要的指標，因此，在質(zhì)量研究過程中迫切需要一種能夠穩(wěn)定、專一的測定生物制品生物學活性的方法。

角化細胞生長因子(Keratinocye?Growth?Factor，簡稱KGF)屬于成纖維細胞生長因子家族，特異性地與上皮細胞受體結(jié)合，刺激上皮細胞的增殖、分化以及遷移，在上皮細胞的增殖與損傷修復中發(fā)揮獨特的功能。目前報道的KGF生物學活性的測定主要通過Balb/MK細胞的胸苷攝入試驗其生物活性，其缺點是，細胞對KGF的刺激不敏感，容易影響對產(chǎn)品質(zhì)量的判斷，因此需要探索新的生物學活性測定方法。

血小板生成素(Thrombopoietin，簡稱TPO)及血小板生成素模擬肽(TPO-mimetide，簡稱TMP)作為一個造血細胞生長因子(hematopoietic?growth?factor，簡稱HGF)，與KGF和紅細胞生成素(Erythropoietin，簡稱EPO)一樣均屬于生長因子(Growth?Heromne，GH)亞家族成員，其生理功能的發(fā)揮主要是通過與靶細胞表面的血小板生成素受體C-Mpl結(jié)合實現(xiàn)的。C-mpl多肽序列全長有633個氨基酸，成熟的C-MPL由胞外區(qū)、穿膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)有兩個受體結(jié)構(gòu)域，遠膜結(jié)構(gòu)域在傳遞TPO的刺激信號中起重要作用，近膜結(jié)構(gòu)域含有保守的WSXWS序列；穿膜區(qū)由22個氨基酸組成且多為疏水性氨基酸；胞內(nèi)區(qū)由122個氨基酸組成，其中脯氨酸和絲氨酸含量分別占12％和11.5％，無典型的蛋白激酶結(jié)構(gòu)，近膜處的Boxl和Box2在信號的傳導中起重要作用，它們的丟失均可失去激活JAKs(Just?anotherkinase或Janus?kinase的簡稱)途徑的功能，而切除C末端20個氨基酸則將失去Shc的磷酸化功能，后者為Ras途徑的起始。

TPO及其類似物的生物學活性測定主要利用Mo7e(人巨細胞白血病細胞株)，該細胞是M-07細胞系的亞系，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte?macrophage?colony?stimulating?factor，簡稱GM-CSF)、人干擾素α抗體(IFN-α)、人干擾素(IFN-ss)、干擾素γ(IFN-γ)、白介素2(Interleukin-2，簡稱IL-2)、白介素3(Interleukin-3，簡稱IL-3)，白介素4(Interleukin-4，簡稱IL-4)、白介素6(Interleukin-6，簡稱IL-6)、白介素15(Interleukin-15，簡稱IL-15)、神經(jīng)生長因子(Nervegrowthfactor，簡稱NGF)、TPO可促進細胞增殖。該細胞也可不依賴細胞因子生長，但生長緩慢，可用于測定多種細胞因子的活性，因此，在生物學活性測定過程中對細胞因子的依賴性較差，并且，實驗室通過實驗證明該細胞株在測定TPO及其類似物生物學活性時，細胞株對TPO及其類似物的不太敏感。同時也有UT-7、TD-3等細胞是通過對細胞進行藥物適應性馴化篩選獲得細胞株，但是經(jīng)過馴化的細胞株在長期的測定過程中性狀容易改變，影響實驗結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供了一種用于生物學活性測定的質(zhì)粒及其制備方法，解決了生物制品質(zhì)量分析過程中建立生物學活性測定方法的難題。

一種用于生物學活性測定的質(zhì)粒，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

上述用于生物學活性測定的質(zhì)粒的制備方法，步驟如下：

(1)用限制性內(nèi)切酶NheI和EcoRI雙酶切pCI-neo質(zhì)粒，插入經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI和EcoRI雙酶切的表達調(diào)控元件(EASE)，構(gòu)建質(zhì)粒pCIneo-ease；

(2)用限制性內(nèi)切酶MluI和XbaI雙酶切步驟(1)制得的質(zhì)粒pCIneo-ease，插入經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluI和XbaI雙酶切的核糖體結(jié)合位點序列(IRES)，構(gòu)建質(zhì)粒pCIneo-ease-IRES；